Molekyyliset geneettiset menetelmät perinnöllisten sairauksien diagnosoimiseksi

DNA-tekniikan menetelmiä käytetään määrittämään lokalisointi tietyssä muuntogeenisen geenin kromosomissa, joka on vastuussa tiettyjen perinnöllisen patologian muodoista. Koska geeni on DNA-segmentti, ja geenin mutaatio - vahinkoa ensisijainen DNA: n rakenteen (mutaatio ymmärtävät kaikki muutokset DNA-sekvenssissä, riippumatta niiden sijainnista ja vaikutus yksittäisten elinkelpoisuus) sitten koettimien valmisteet metafaasin potilaan kromosomien perinnöllinen sairaus, voidaan vahvistaa patologisen geenin lokalisointi. Molekyyligenetiikan menetelmät luovat mahdollisuuksia diagnosoida sairauksia muunnetun DNA-rakenteen tasolla, ja ne mahdollistavat perinnöllisten häiriöiden lokalisoitumisen. Molekyyliset geneettiset menetelmät voivat paljastaa mutaatioita, jotka liittyvät jopa yhden emäksen korvaamiseen.

Merkittävin vaihe geenin tunnistamisessa on sen eristäminen. DNA voidaan eristää mistä tahansa kudoksesta ja solusta sisältävistä ytimistä. Vaiheet DNA: n eristystä varten sisältyvät nopea solujen lyysin sentrifugoimalla poistamalla fragmenttien soluelinten ja kalvot, entsymaattinen tuhoaminen proteiinien ja niiden erottaminen liuoksesta fenolilla ja kloroformilla, DNA-pitoisuus saostamalla etanolissa.

Geneettisissä laboratorioissa DNA eristetään useimmiten veren leukosyytteistä, ja potilaalle otetaan 5 - 20 ml laskimoversiota steriilissä putkessa antikoagulanttiliuoksella (hepariini). Sitten leukosyytit erotetaan ja käsitellään yllä kuvattujen vaiheiden mukaisesti.

Seuraavassa vaiheessa aineen valmistuksesta tutkimus - DNA "leikkaa" palasiksi paikoissa, joissa on ainoastaan spesifinen emässekvenssin suoritetaan avulla bakteerien entsyymien - restriktioendonukleaaseilla (restriktioentsyymeillä). Restriktioentsyymit tunnistavat spesifisiä sekvenssejä 4-6, ainakin 8-12 nukleotidia kaksijuosteiseen DNA-molekyyli ja sen erottaa näiden sekvenssien fragmentteja paikallistaa kohdissa, joita kutsutaan restriktiokohtia. Valmistettujen restriktio-DNA-fragmenttien määrä määritetään restriktiokohtien taajuudella ja fragmenttien koko määritetään jakamalla nämä paikat alkuperäisen DNA-molekyylin pituudelta. Mitä useammin restriktiokohteet sijaitsevat, sitä lyhyempi DNA-fragmentit rajoituksen jälkeen. Tällä hetkellä tunnetaan yli 500 erilaista bakteeriperäistä restriktioentsyymiä ja kukin näistä entsyymeistä tunnistaa sen spesifisen nukleotidisekvenssin. Tulevaisuudessa restriktiokohtia voidaan käyttää geneettisiksi markkereiksi DNA: lle. Saatu DNA restriktiofragmentit voidaan lajitella pituuden mukaan elektroforeesilla agaroosi- tai polyakryyliamidigeeleissä, ja näin voidaan määrittää niiden molekyylipaino. Yleensä DNA: n ilmaisemiseksi geelissä käytetään spesifistä värjäytymistä (yleensä etidiumbromidia) ja katsella geeli lähetetty valo ultravioletti. DNA-lokalisoinnin sijainnit ovat punaisia. Kuitenkin henkilö käsittelyssä useiden DNA-restriktioendonukleaaseilla muodostettu niin monia eri pituisia fragmentteja, että ne eivät voi erottaa elektroforeesilla, se ei ole mahdollista visuaalisesti tunnistaa yksilön DNA-fragmentteja electrophoregram (valmistettu yhtenäinen väri koko pituudelta geelin). Siksi käytetään hybridisaatiomenetelmää leimattujen DNA-koettimien kanssa halutun DNA-fragmentin identifioimiseksi tällaisessa geelissä.

Mikä tahansa DNA: n tai RNA: n yksijuosteinen segmentti kykenee sitomaan (hybridisoitua) sen komplementaariseen ketjuun ja guaniini liittyy aina sytosiiniin, adeniiniin ja tymiiniin. Tämä on kaksisäikeisen molekyylin muodostuminen. Jos yksijuosteisen kopion kloonatun geenin merkitä radioaktiivinen leima, koettimena. Koetin kykenee löytämään komplementaarisen DNA-segmentin, joka sitten tunnistetaan helposti radioautografialla. Radioaktiivinen koetin lisätään lääkeaineen venytetty kromosomien mahdollistaa paikallistaa geenin tiettyyn kromosomiin DNA-koetin voidaan tunnistaa tietyt osat on Southern blot. Hybridisaatio tapahtuu, jos DNA: n testiohjelma sisältää normaalin geenin. Tapauksessa, jossa esiintyy epänormaali nukleotidisekvenssi, toisin sanoen vastaavat kromosomirakenteet sisältävät mutanttigeenin, hybridisaatiota ei tapahdu, mikä mahdollistaa patologisen geenin lokalisoinnin.

DNA-koettimien saamiseksi käytetään geenin kloonausmenetelmää. Ydin menetelmä koostuu siitä, että DNA-fragmentti, joka vastaa mihin tahansa geeniin tai geenin alueen insertoidaan kloonausta hiukkanen, yleensä bakteeriplasmidin (pyöreä kromosomin DNA: ta on läsnä bakteerisoluissa ja kuljettaa resistenssigeenit antibiootteja), ja sitten bakteerit joilla on plasmidi sisäänrakennetulla ihmisen geenillä, kerrotaan. Koska synteesi prosesseja on mahdollista saada plasmidi miljardeja kopioita ihmisen geeni tai sen osa.

Lisäksi DNA-kopioita, jotka on leimattu radioaktiivisella leimalla tai fluorokromeilla, käytetään koettimiin etsimään komplementaarisia sekvenssejä tutkittujen DNA-molekyylien joukossa.

Tällä hetkellä on olemassa monenlaisia menetelmiä, joissa käytetään DNA-koettimia geenimutaatioiden diagnosointiin.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],