Tuberkuloosin laboratoriodiagnoosi

Tuberkuloosi on sairaus, joka on helppo diagnosoida nykyaikaisissa olosuhteissa ja tieteellisissä saavutuksissa. Tuberkuloosin laboratoriodiagnoosi on keskeinen muissa diagnostisissa menetelmissä, toisin kuin vain röntgentutkimusmenetelmissä.

[1], [2], [3], [4],

Kliininen verikoke

Tuberkuloosipotilailla veren yleisen analyysin muutokset eivät ole patognomoneja. Rajoitettu ja inaktiivisten muotojen tuberkuloosin hypochromia ominaista erytrosyyttien normaalin määrä. Kun massiivinen infiltraatit tai juustomainen keuhkokuume, kun taas esiintyvyys juustomainen lymfadeniitti erityisiä suoliston haavaumat sekä suurille keuhko- tai leikkauksen jälkeistä verenvuotoa ja huomata punasoluniukkuutta microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrosytoosia ja vielä poikilosytoosia harvinaisempi, yleensä vaikea anemia. Määrä retikulosyyttien vaiheessa tuberkuloosi kompensoida vaihtelee 0,1-0,6%, ja subcompensated - 0,6-1,0% ja 1% on tunnettu siitä, että dekompensoitunut retikulosyyttien.

Kun tuberkuloosi joissakin tapauksissa voi olla kohtalainen leukosytoosi (enintään 15000 leukosyyttien.), Vähemmän säteilyä, joka esiintyy 2-7%: lla potilaista, joilla rajoitettu ja helppo prosessi esiintyvien muotojen ja 12,5% - tuhoava ja progressiivinen keuhkotuberkuloosi .

Yleisimmät siirtymät esiintyvät leukosyytti-kaavassa. Merkitse sekä suhteellinen että absoluuttinen neutrofilia, leukosyyttikuvion kohtalainen muutos vasemmalle ennen promyelosyyttejä. Myelosyytit ovat hyvin harvinaisia, kun kyseessä on yksinkertainen tuberkuloosi. Määrän lisääminen neutrofiilien epänormaali viljan haemogram tuberkuloosipotilaista aina ilmaisee prosessin kestoa: potilaalla on vaikea tuberkuloosi lähes kaikkien neutrofiilien sisältävät epänormaaleja viljaa. Kun tuberkuloosin puhkeaminen lakkaa, ydinaseen siirtyminen suhteellisen nopeasti lähestyy normaalia. Neutrofiilien patologinen rakeisuus pysyy tavallisesti pidempään kuin muut muutokset hemogramissa.

Eosinofiilien pitoisuus ääreisveressä vaihtelee myös prosessin vaiheen ja organismin allergisen tilan mukaan. Niiden määrä vähenee, kunnes aneozinofiliya vakavan ja pitkittyneen taudin puhkeamisen ja, päinvastoin, kasvaa, kun resorptiota ja keuhko- effuusio, sekä varhainen muotoja ensisijainen tuberkuloosi.

Useimpien primaarisen tuberkuloosin muodoista seuraa lymfopenia, jota joskus esiintyy useiden vuosien ajan myös erityisten muutosten arpeutumisen jälkeen. Toissijainen tuberkuloosi pahenemisvaiheessa, prosessin vakavuudesta riippuen, voi liittyä joko normaali määrä lymfosyyttejä tai lymfopenia.

Se on erityinen paikkansa määrittämiseksi lasko Lisätestit arvioida tuberkuloottinen prosessi (ESR), jonka arvo arvioitaessa virtaus tuberkuloosi prosessi ja tunnistamiseksi sen aktiiviset muodot. Kasvu ESR osoittaa läsnä ollessa patologisen prosessin (tarttuva-inflammatorinen, märkivän septinen, hemoblastosis, Hodgkin et ai.) Ja osoittaa sen vakavuudesta, mutta normaalit tasot ESR ei aina osoittavat ilman patologian. Veren punasolujen sedimentaation kiihdyttämistä helpottaa globuliinien, fibrinogeenin, veren kolesterolipitoisuuden lisääntyminen ja veren viskositeetin väheneminen. Hemmentyminen erytrosyyttien sedimentaatiosta on ominaista valtioiden mukana hemoconcentration, lisäys albumiinien ja sappihappoja.

Hemogrammi potilailla, joilla on tuberkuloosi, muuttuu hoidon aikana. Hematologiset siirtymät häviävät, sitä nopeammin, sitä parempi hoito. On kuitenkin pidettävä mielessä erilaisten antibakteeristen lääkkeiden hemopoieesia. Ne aiheuttavat usein eosinofiliaa, joissakin tapauksissa - leukosytoosi, ja useammin leukopenia agranulosytoosiin ja lymfoidiharjoituksiin saakka. Systemaattinen hematologinen kontrolli ja oikean tiedon analysointi ovat välttämättömiä potilaan kliinisen tilan, prosessin dynamiikan ja käytetyn hoidon tehokkuuden arvioimiseksi.

[5], [6], [7], [8], [9],

Virtsan kliininen analyysi

Virtsajärjestelmän tuberkuloosin takia urinaalinen analyysi on tärkein laboratoriodiagnostiikka. Voit tarkkailla leukosyyturia, erytrosyturia, proteinuria, hypoisistenturia, tuberkuloosi mycobacterium, epäspesifinen bakteriuria.

Leukosyturia on virtsajärjestelmän tuberkuloosin yleisimpiä oireita ennen spesifistä kemoterapiaa, ja se puuttuu vain poikkeustapauksissa, esimerkiksi kun ureteraalivuora on kokonaan poistettu. Nechyporenko testi (määritys, valkosolujen 1 ml: ssa virtsaa) auttaa lisää objektiivisesti asteen arvioimiseksi leukocyturia nefrotuberkuloze kanssa, ja joissakin tapauksissa se voidaan tunnistaa normaali virtsa. On kuitenkin otettava huomioon, että leukosyturia voi ilmetä akuuteissa ja kroonisissa pyelonefriitissa, kystiitti-, uretriitti-, munuais- ja virtsakivissä.

Eritrotsiturii. Samoin kuin leukosyturia. Pidetään yhtenä tavallisimmista virtsatieteellisen järjestelmän tuberkuloosin laboratorio-oireista. Hemuraasin taajuus riippuu prosessin esiintyvyydestä, se lisääntyy, kun tuhoava tuberkuloosiprosessi kehittyy munuaisissa. Erythrocyturia ilman leukosyturiaa on tyypillisempää munuaisen tuberkuloosin varhaisille vaiheille. Hematuria, joka vallitsee leukosyturiaa vastaan, on tärkeä väite munuaisen tuberkuloosin hyväksi erilaistumisessa epäspesifisen pyelonefriitin kanssa.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Biokemiallinen veritesti

Tuberkuloosilla muutokset joissakin biokemiallisissa parametreissä riippuvat ensisijaisesti prosessin vaiheesta, komplikaatioista ja erilaisista samanaikaisista sairauksista. Keuhkoissa ja muissa elimissä inaktiivisen tuberkuloosin potilailla veren seerumin kokonaisproteiini- ja proteiinifraktiot ovat muuttumattomia ja määrittävät niiden normaalin sisällön.

Akuutissa taudin muodoissa sekä kroonisten tuberkuloosilääkkeiden pahenemisessa ja etenemisessä albumiini-globuliinipitoisuus pienenee.

Olennainen arvioitaessa toiminnallista tilaa orgaanisia vaurioita ja maksan tuberkuloosin ja sen komplikaatioiden on seerumin kokonais- ja suora bilirubiini, AST (ACT), alaniiniaminotransferaasin (ALT). Aminotransferaasien tason dynaaminen määritys. Tuberkuloosipotilaiden hoidossa, erityisesti vaikeissa muodoissa, bilirubiini on pakollinen komponentti tuberkuloosipotilaiden biokemiallisessa tutkimuksessa, ja se suoritetaan kuukausittain.

Munuaisten toiminnallisen tilan arviointiin kuuluu seerumin kreatiniinin määritys ja glomerulusten suodatusnopeuden laskeminen Cockcroft-Gault-kaavan mukaisesti. Glomerulaarisen suodatusnopeuden laskeminen käyttäen Rebergin näytettä antaa vähemmän tarkkoja tuloksia.

Tuberkuloosipotilaiden dynaamisten biokemiallisten tutkimusten päätavoitteena on seurata prosessin kulkua, huomata sivuvaikutuksia ja havaittavia homeostaattisia häiriöitä riittävästi korjaamaan.

[17], [18], [19]

Sovelletaan biokemiallisia tutkimusmenetelmiä ekstrapulmonaaliseen tuberkuloosiin

Tärkein indikaattori on tuberkuloosahappojen pitoisuus biologisissa nesteissä, mutta sen määritelmä liittyy teknisiin vaikeuksiin (kaasukromatografia ja massaspektrometria).

Adenosiinidaminaasin aktiivisuuden mittaaminen - nesteissä määritetty entsyymi: synovial, perikardiaalinen, ascitic tai selkäydin. Adenosiinideaminaasin tärkeimmät tuottajat ovat lymfosyytit ja monosyytit. Adenosiinidaminaasin aktiivisuuden määrittäminen biologisissa nesteissä helpottaa tuberkuloosin synoviitin diagnosointia, imusolmukkeiden tuberkuloosia, tuberkuloosin aivokalvontulehdusta, tuberkuloosi-sertiittia.

Jotkut biokemialliset indikaattorit, jotka johtuvat epäspesifisyydestä, määräytyvät vain biologisissa nesteissä, lähellä leesiotarkennusta. Mittaa indikaattorien taso tuberkuliinin ihonalaisesti tai ihonsisäisesti (yleensä ennen 48 ja 72 tuntia sen jälkeen). Tämän jälkeen merkintätason nousun aste (prosentteina) lasketaan suhteessa alkuperäiseen tasoon.

Optimaalinen määritys transamnidaasin organispesifisen entsyymin aktiivisuudesta virtsaan, jonka ulkonäkö on havaittavissa erilaisten munuaisten vajaatoiminnassa. Transamidinaasin tutkimus on perusteltua vain tuberkuliinin injektionesteissä paikallisen tulehdusprosessin pahentamiseksi. Määritä transamidiinin aktiivisuus virtsaan aluksi ja 24-72 tunnin kuluttua 50 TE tuberkuliinin käyttöönotosta. Fermentaation laajentaminen 2 kertaa ja enemmän mahdollistaa 82%: ssa tapauksen erottamaan munuaisten aktiivisen tuberkuloosin kroonisen pyelonefriitin pahenemisesta.

Naisten sukupuolielinten tuberkuloosilla haptoglobiinin ja malonidialdehydin pitoisuudet veressä määritetään provokatiivisen tuberkuliinitestin olosuhteissa. Injektoitu ihonalaisesti tuberkuliini annoksella 50 TE ja 72 tunnin kuluttua suoritettiin toinen biokemiallinen tutkimus. Tuberkuloosin etiologiassa haptoglobiinipitoisuuden nousuvauhti on vähintään 28% ja malondialdehydin taso on 39% tai enemmän. Käytetään myös adenosiinideaminaasin aktiivisuuden määrittämistä Douglas-avaruudessa saadusta peritoneaalisesta nesteestä. Punktaaattia tutkitaan uudelleen 72 tuntia tuberkuliinin intradermaalisen injektion jälkeen 0,1 TE: n ja 0,01 TE: n annoksilla sisäisten sukupuolielinten projisointiin etupään vatsan seinälle. Tuberkuloosiprosessin hyväksi adenosiinideaminaasin aktiivisuuden kasvu on 10% tai enemmän verrattuna alkuperäiseen.

Kun silmä vaikuttaa, tutkitaan tarkkailua, joka tapahtuu silmässä antigeenisen stimulaation vasteena. Ei ole toivottavaa kehittää voimakasta vastausta, johon liittyy visuaalisten toimintojen väheneminen. Koska minimaalisten polttoreaktioiden arvioiminen on usein vaikeaa, johtopäätöksen objektiivisuuden vuoksi suositellaan suuntautumista rinnakkain ja haptoglobiinin tai adenosiinideaminaasin veriseerumin kasvun astetta.

Kaikki biokemialliset tutkimukset on suoritettava yhdessä muiden menetelmien kanssa.

[20], [21], [22], [23],

Veren hyytymisjärjestelmän tutkimus

Relevanssi Tutkimuksen tilan veren hyytymiseen TB johtuu läsnäolo useita potilaita, joilla on keuhkotuberkuloosi veriyskökset tai keuhkojen verenvuoto sekä hemocoagulation komplikaatioita leikkaushoitoa tuberkuloosin. Lisäksi, luonnollisesti liittyvät TB piilevänä virtaava suonensisäisen hemocoagulation vaikuttaa sairauden kulkuun ja kemoterapian tehokkuuden.

Potilailla, joilla on keuhkotuberkuloosi esiintyvyys exudative tulehdus komponentin supistuminen veressä antikoagulanttitehoon. Potilailla, joiden esiintyvyys on alhainen tietyn vaurio keuhkoissa, joista suurin osa tuottava hemocoagulation suonensisäisen tulehduksellinen komponentti ilmaistuna hieman. Potilaille, joilla on keuhkotuberkuloosi ja Veriyskä ja keuhkojen verenvuoto tila veren hyytymiseen on erilainen: potilailla, joilla on alhainen veren menetys korkeudella gemoptoe tai välittömästi sen päätyttyä on jyrkkä nousu veren hyytymisen kyky johtuvat vakavista tehostuminen trombinoobrazovaniya säilyttäen lisääntynyt "rakenteellinen" hyytymistä. Potilailla, joilla on suuri verenhukka, koagulaatiopotentiaalin väheneminen havaitaan fibrinogeenin pitoisuuden vähenemisen vuoksi. Tekijä XIII -aktiivisuus, verihiutaleiden määrä. Kirurgisen hoidon vaiheessa potilaat, joilla on rajoitettu tuberkuloosi, eivät ole lieviä merkittäviä häiriöitä homeostaasin järjestelmässä. Potilaat, joilla on laajalle levinnyt menetelmä suorittaessaan pnevmon- tai plevropnevmonektomii kehittävät usein DIC, joka voi olla muodoltaan "toinen tauti."

Seurattaessa veren hyytymistä potilailla, joilla on keuhkotuberkuloosi olisi suoritettava määritys aktivoitua osittaista tromboplastiiniaikaa (aPTT), fibrinogeeni, trombiini aika, protrombiini indeksi ja vuotoaikaan ja hyytymisaika.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonaalinen tutkimus

Nykyaikaiset kokeelliset ja kliiniset havainnot osoittavat hormonaalisen tilan muutosten esiintymisen spesifisessä tuberkuloosista tulehduksessa. On osoitettu, että korjaus toimintahäiriön aivolisäke-lisämunuaisen, aivolisäkkeen-kilpirauhasen järjestelmien ja haiman toiminta yhdessä anti-TB hoito edistää aktivointi fibrogeneesiä ja korjaus kasvupaikalla erityinen tulehdus.

Toiminnallista tilaa aivolisäkkeen kilpirauhasen järjestelmä arvostellaan sisällön veriseerumissa trijodityroniinin (T ₃ ), tyroksiinin (T ₄ ), aivolisäkkeen kilpirauhasta stimuloiva hormoni (TSH). Todettiin, että piilevä kilpirauhasen havaitaan 38-45%: lla potilaista, joilla on keuhkotuberkuloosi, ja useimmiten se on diagnosoitu disseminoitunut ja fibro-syvä muodoissa prosessi. Näissä samanmuotoinen dramaattisimmin alenemisesta sekä T ₃ ja T ₄, ja siellä tulee epätasapaino näiden hormonien muodossa suhde kasvaa T ₄ / T _s.

Lisämunuaiskuoren toiminta arvioidaan taso kortisolin veren seerumin, ja umpieritykseen haima - pitoisuus immuno-reaktiivisen insuliinia. Tarttuvan taudin akuutissa vaiheessa endogeenisen kortisolin ja insuliinin tarve kasvaa. Hyperinsulinemia todistaa myös kehon kudosten insuliiniresistenssistä, joka on tyypillistä mitä tahansa aktiivista tulehdusprosessia varten, erityisesti spesifiseksi. Lisäkilpirauhasen glukokortikoidifunktion määrittäminen aktiivisen keuhkoveren tuberkuloosin kanssa mahdollistaa hyperkorttismin esiintymisen useimmilla potilailla. Normaali kortisolin pitoisuuden veressä potilaan kanssa tarttuvan tulehduksen akuutin aikana olisi pidettävä suhteellisen epäonnistumisen glukokortikoidin toiminta ja lisämunuaisen kuoren, joka voi toimia perustana, jolla annosten riittävä korvaushoito glukokortikoidien.

Lähes kolmannes potilaista, joilla on keuhko tuberkuloosi, voi todeta, että niiden insuliinipitoisuus on melko alhainen ja lähestyy normaalin alarajaa, kun taas 13-20% havaitsee merkittävää hyperinsulinismia. Sekä suhteellinen hypo- että hyperinsulinismi ovat suuria riskitekijöitä erilaisten hiilihydraattien aineenvaihdunnan loukkausten kehittymiselle. Nämä haimatulehduksen B-solujen toiminnalliseen toimintaan liittyvät muutokset edellyttävät säännöllistä seurantaa glykemialla potilailla, joilla on tuberkuloosi ja diabetes mellituksen ennenaikainen ehkäisy. Lisäksi. Tämä toimii lisäedellytyksenä fysiologisten insuliiniannosten käyttämiselle tuberkuloosin monimutkaisessa hoidossa.

Yleensä alhaisemmat kilpirauhashormonitasojen ja niiden epätasapaino hyperkortisolismista ja hyperinsulinism suurin saavutettavissa potilaalla on vaikea kuluessa tuberkuloosi prosessin, joilla on laaja keuhkovaurioita ja vakavia oireita tuberkuloosin myrkytyksen.

Tuberkuloosin mikrobiologinen diagnoosi

Mikrobiologiset tutkimukset ovat välttämättömiä tuberkuloosilääkkeiden tunnistamiseksi, kemoterapian diagnosoinnin, seurannan ja korjata- misen tarkistamiseksi ja hoidon tulosten arvioimiseksi, toisin sanoen siitä hetkestä lähtien, kun potilas on rekisteröity tuberkuloosiin ennen sen ottamista.

Kaikki epidemiologiset ohjelmat ja hankkeet perustuvat bakteerien eritteiden lukumäärään, jota ei voida tehdä ilman laboratoriomenetelmiä mykobakteerien tuberkuloosin havaitsemiseksi. Ns. Organisoitumattoman väestön tutkimuksessa bakteerien hyökkääjien prosenttiosuus on 70 tai enemmän, mikä tekee laboratoriomenetelmistä riittävän tehokkaan keinon tunnistaa tuberkuloosipotilaat tämän väestöryhmän keskuudessa.

Perinteiset mikrobiologiset menetelmät tuberkuloosin diagnosoimiseksi ovat bakterioskooppiset ja kulttuurikysymykset. Nykyaikaiset menetelmät pitävät mykobakteerin tuberkuloosin viljelyä automaattisissa järjestelmissä, PCR: n asettamisessa. Kaikki nämä menetelmät kuitenkin välttämättä yhdistetään klassisiin bakteriologisiin menetelmiin.

Diagnostiikkamateriaalin kokoaminen

Laboratoriotutkimusten tehokkuus riippuu suurelta osin diagnostisen aineiston laadusta. Diagnostiikkamateriaalin keräämistä, tallentamista ja kuljettamista koskevien sääntöjen noudattaminen ja potilaan arviointisalgoritmin tarkka täytäntöönpano vaikuttavat suoraan lopputulokseen ja varmistavat biologisen turvallisuuden.

Tuberkuloosin testaamiseen käytetään erilaisia materiaaleja. Johtuu siitä, että TB logkih- yleisin muoto tuberkuloottinen vaurioita, perusmateriaali tutkimuksen harkita yskös ja muita irrotettavia trakeobronkiaalisen: ylempien hengitysteiden eritteissä jälkeen saatu aerosoli on hengitetty: keuhkoputken pesut; bronchoalveolar huuhtelut; saadun materiaalin bronkoskopia, ja intrapulmonaalinen transtrakeaalista biopsiat keuhkoputkien aspiraatteja, kurkunpään pyyhkäisynäytteeseen, eritteitä haavojen ja tahroja ai.

Tutkimuksen tehokkuus lisääntyy, jos potilasta valvotaan kontrolloidusti. Tätä tarkoitusta varten on varattu erityinen huone tai hankitaan erikoisohjaamoja. Materiaalikokoelma on vaarallinen menettely, joten on tarpeen kerätä materiaalia tutkimukselle, noudattamalla tarttuvan turvallisuuden sääntöjä.

Mycobacterium tuberculosis -kokeen materiaali kerätään steriileihin pulloihin tiukasti kierretyillä korkkeilla, jotta estetään ympäristön saastuminen ja suojataan kerätty materiaali saastumiselta.

Diagnostiikkamateriaalin keräyspullot täyttävät seuraavat vaatimukset:

• on valmistettava iskunkestävästä materiaalista;
• pitäisi helposti sula autoklaavin aikana;
• on riittävä tilavuus (40-50 ml):
• on laaja aukko ysköksen keräämiselle (halkaisija vähintään 30 mm);
• on helppo käsitellä, läpinäkyvä tai läpikuultava, jotta voit arvioida kerätyn näytteen määrän ja laadun avaamatta kansiasi.

Optimaalisten tutkimustulosten saavuttamiseksi on noudatettava seuraavia ehtoja:

• Kerää materiaali ennen kemoterapian aloittamista.
• tutkimuksen aineisto on kerättävä ennen aterianottoa elintarvikkeisiin ja lääkkeisiin;
• tutkimusta varten on toivottavaa kerätä vähintään kolme aamuelän näytettä. Kerää yskä 3 peräkkäisen päivän ajan;
• kerätty materiaali on toimitettava laboratoriolle mahdollisimman pian:
• jos materiaali on välittömästi mahdotonta toimittaa laboratoriolle, se säilytetään jääkaapissa 4 ° C: n ilman lämpötilassa enintään 48 tuntia;
• Materiaalin kuljetuksessa on välttämätöntä tarkkailla injektiopullojen eheyttä.

Oikein kertynyt yskö on limakalvoa tai limakalvoa. Testattujen ysköksen optimaalinen tilavuus on 3-5 ml.

Yskös on kerätty lääkärin valvonnassa. Nokkelin keräämisestä vastaavien henkilöiden olisi noudatettava tiettyjen sääntöjen täytäntöönpanoa:

• on tarpeen selittää potilaalle tutkimuksen tarkoitus ja tarve lievittää sylkeä tai suolistohouma, mutta syvän hengitysteiden sisältö. Tämä voidaan saavuttaa tuloksellisen yskän seurauksena, joka esiintyy useiden (2-3) syvään hengityksen jälkeen. On myös varottava potilasta, että hänen huuhtele suunsa kiehuvalla vedellä poistaakseen suuontelossa kasvavien mikrofloorien pääosan ja ruoan jäämät, jotka estävät yskän tarkastamisen;
• kylpyhuonekalujen ja hattujen lisäksi jalkojen keräämiseen osallistuvan lääkintähenkilökunnan on käytettävä naamioa, kumihansikkaita ja kumipeite;
• seisoo potilaan takana, hänen on suositeltavaa pitää pullo mahdollisimman lähelle huulilleen ja välittömästi erottua siihen vyyhtiin, kun se yskää, ja on säädettävä, että ilmavirta ohjataan terveydenhuollon työntekijältä:
• Ystävien keräämisen jälkeen terveydenhuollon työntekijä sulkee injektiopullon varovaisesti kannella ja arvioi kerätyn ysköksen määrän ja laadun. Sitten pullo leimataan ja asetetaan erityiseen boksiin kuljetettavaksi laboratoriolle.

Jos potilas ei tuota limaa, iltana ja varhain aamulla keräyspäivänä materiaalin tarpeen antaa hänelle yskänlääke :. Ote juurista vaahtokarkkia (mukaltin), bromiheksiiniä, ambroxol jne - tai soveltaa ärsyttävää hengitettynä asennetun laitteiston avulla huoneeseen keräämään yskös. Tällä tavoin kerättyä materiaalia ei ole suojeltava, ja sitä olisi tarkasteltava keräyspäivänä. Jotta vältetään sen "sieppaus" laboratoriossa suuntaan pitäisi tehdä erityinen merkki.

Jos mikrobiologisia tutkimuksia ei suoriteta tässä laitoksessa, kerätty diagnostinen aine on toimitettava keskitetysti laboratorioon edellyttäen, että materiaali säilyy jääkaapissa tai säilöntäaineiden käytön välisinä välein. Toimitetaan materiaali laboratoriossa kuljetuslaatikoissa, jotka voidaan helposti desinfioida. Jokaisessa näytteessä olisi oltava asianmukainen merkintä ja koko erä olisi täytettävä oheisella lomakkeella.

[29], [30], [31],

Potilaiden tutkimuksen tavat ja esiintymistiheys

Potilaan tuberkuloosin alkuperäisessä, ns. Diagnostisessa tutkimuksessa on tarpeen tutkia vähintään 3 ysköstä 2 tai 3 vuorokauden ajan. Kerätään lääketieteellisen henkilöstön valvonnassa, mikä lisää mikroskopian tehokkuutta.

Tuberkuloosin primaarinen seulonta on suoritettava kaikkien terveydenhuoltojärjestelmän lääketieteellisissä diagnostisissa laitoksissa. Viime aikoina on järjestetty kliinisten diagnostisten laboratorioiden perusteella ns. Mikroskopian keskuksia, jotka on varustettu nykyaikaisilla mikroskoopilla ja epidemian turvallisuutta omaavilla laitteilla, jotta alkututkimuksen tehokkuus paranee.

Anti-tuberkuloosilaitteissa käytetään seulontatestiä, joka sisältää ysköstutkimuksen tai muun diagnostisen aineen vähintään kolme kertaa 3 päivän ajan. Hoidon aikana mikrobiologiset tutkimukset suoritetaan säännöllisesti vähintään kerran kuukaudessa intensiivisen kemoterapiavaiheen aikana. Siirtyessä hoidon vaiheeseen tehdään tutkimuksia harvemmin - 2-3 kuukauden välein, kun taas tutkimuksen taajuus pienenee kahteen.

Diagnostiikkamateriaalin keräämisen ominaisuudet extrapolmonaaliseen tuberkuloosiin

On patologinen materiaali ekstrapulmonaalinen muotoja TB - Mycobacterium tuberculosis alhainen pitoisuus se, joka vaatii herkempi mikrobiologiset tutkimukset, ensisijaisesti kylvö tekniikoita väliaineessa.

Virtsa on virtsaputkimenetelmän tuberkuloosi kaikkein helpoin oppimateriaali. Virtsan keräämistä tulee tehdä erityisesti koulutetulla hoitajalla.

Ulkopuoliset sukupuolielimet pestään vedellä saippualla tai heikolla kaliumpermanganaatin liuoksella. Virtsaputken ulkoista avaamista käsitellään huolellisesti. Steriilissä injektiopullossa keskimääräinen osa aamu-virtsaa kerätään: miehillä, luonnollisesti, naisilla, käyttäen katetria. Virtsan munuaisen lantion keräämisestä steriileihin putkiin katetrisoidaan yksi tai kaksi munuaista, jälkimmäisessä tapauksessa - välttämättä erikseen jokaisesta munuaisesta. Pieni määrä tätä virtsaa sentrifugoidaan, sedimenttiä tutkitaan.

Ihmisillä, siemennesteellä, punctate kiveksillä, eturauhasen salaisuus altistetaan sentrifugoimiseksi sakan saamiseksi. Missä tahansa miesten spesifisessä prosessissa sukupuolielinten alueella eturauhasen hieronta voi edistää mycobacterium tuberculosis -eritystä sisältävien eritteiden erittymistä.

Kuukautisverta naisilla kerätään imemällä tai käyttämällä Kafka-korkkia. Saatu aine vapautuu punasoluista, pestään se tislatulla vedellä ja sen jälkeen sentrifugoimalla. Sakka tutkitaan.

Kohdunkaulan kohdun limakalvot kootaan jossakin Kafka-kapasiteetissa tai korkissa, toisin sanoen on toivottavaa kerätä 1-2 ml patologista materiaalia.

Materiaali, joka on saatu operatiivisista toimenpiteistä munuaisissa ja sukupuolielimissä. Biopsiat, limakalvot endometriumista, homogenisoidaan. Tätä varten se sijoitetaan steriiliin laastiin ja murskataan perusteellisesti steriileillä saksilla. Tähän lietteeseen lisättiin steriiliä jokihiekka määrä, joka on sen painoon, ja sitten päällä kanssa 0,5-1.0 ml: aan isotonista natriumkloridiliuosta, ja kaikki trituroitiin, kunnes tahnamainen massa, johon on lisätty isotonista natriumkloridiliuosta (4-5 ml). Sitten massan annetaan laskeutua 1-1,5 minuutin ajan, supernatantti tutkitaan.

Luiden ja nivelten tuberkuloosi. Steriloidulla ruiskulla saatu punctate (pussi) sijoitetaan steriileihin astioihin ja välittömästi toimitetaan laboratoriolle. Steriilillä pipetillä, ennalta kostutettu steriiliin isotoniseen natriumkloridiliuokseen, ottaa 2-5 ml mätä, se siirrettiin ampulliin helmiä lisättiin ja toisen 2-3 ml: lla isotonista natriumkloridiliuosta. Pullo suljetaan korkilla ja ravistellaan jokeri-laitteessa 8-10 minuuttia. Homogenoidusta suspensiosta tutkitaan.

Osteoartikkelisen tuberkuloosin fistulaarisissa muodoissa otetaan pussi fistolasta. Runsas purkaus kerätään suoraan koeputkeen. Jos pusso on erilainen, fistula pestään steriilillä isotonisella natriumkloridiliuoksella ja tutkimusprosessiin kerätty pesuvesi tai pussiin kyllästetty tamponin osa lähetetään tutkimukseen.

Kirurginen saatua materiaalia leikkauksen aikana luut ja nivelet voivat koostua märkivä-nekroottisen massat, granulations, arpi, luukudoksen nivelkaivoissa ja muilla pinnoilla. Sen hoito suoritetaan, kuten munuaisten tuberkuloosissa.

Synovial-nesteiden mikrobiologista tutkimusta 3-prosenttisessa natriumsitraattiliuoksessa (1: 1 suhde) hyytymisen estämiseen suoritetaan välittömästi pistoksen jälkeen.

Imusolmukkeiden tuberkuloosi. Myös imusolmukkeiden puhkeamisen aikana uutettu pussi tutkitaan. Kuin paiseita pus. Kliinisten imusolmukkeiden kudoksia, jotka on saatu kirurgisten toimenpiteiden aikana, biopsia, tutkitaan, samoin kuin muiden tuberkuloosilajien tapaan.

Mycobacterium tuberculosis -taudin massojen tutkimus on erittäin harvinaista, koska positiivisten tulosten lähes täydellinen puuttuminen johtuu.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mycobacterium-mikroskooppi

Yskösmikroskopia on suhteellisen nopea, yksinkertainen ja edullinen menetelmä, jota olisi käytettävä kaikissa tapauksissa, joissa epäillään tuberkuloosia. Lisäksi tämä tutkimus suoritetaan kemoterapian tehokkuuden arvioimiseksi ja hoidon toipumisen tai epäonnistumisen selvittämiseksi, ellei viljelmäkokeita ole.

Käytetään kahdella mikroskooppitutkimusmenetelmällä:

• suoramikroskopian menetelmä, kun tahra valmistetaan suoraan diagnostisesta materiaalista;
• menetelmä sedimentin mikroskoopille, joka on valmistettu dekontaminanttia käsitellystä materiaalista viljelmälle.

Ensimmäistä menetelmää käytetään niissä laboratoriossa, joissa suoritetaan vain mikroskooppisia tutkimuksia (yleisen lääketieteellisen verkon kliiniset ja diagnostiset laboratoriot).

Mikroskooppisen tutkimuksen parhaat tulokset saadaan keskittymällä diagnostiseen materiaaliin (esimerkiksi sentrifugoimalla).

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin havaitsemiseksi 50 prosentin todennäköisyydellä mikroskopian suorittamisessa 1 ml: n ysköstä tulisi sisältää yli 5000 mikrobisolut. Tuberkuloosin keuhkoihin liittyvien potilaiden kouristukset sisältävät tavallisesti huomattavan määrän haponkestäviä bakteereja, joiden ansiosta ne voidaan luotettavasti havaita bakteerikopialla. Tämän menetelmän diagnostista herkkyyttä voidaan parantaa tutkimalla useita ysköksenäytteitä yhdestä potilaasta. Bakterioskooppisen tutkimuksen kielteinen tulos ei sulje pois tuberkuloosin diagnoosia, koska joidenkin potilaiden kömpelöllä on vähemmän mykobakteereja kuin mikroskoopilla voidaan havaita. Huudot yskänkäsittelyn valmisteet voivat myös aiheuttaa negatiivisen tuloksen bakteeriskooppisesta tutkimuksesta.

Yleisimpiä menetelmää hapon nopeiden mykobakteerien havaitsemiseksi tahroina on väri Tsiol-Nelsenin mukaan. Menetelmä perustuu karbiinifossiinin tunkeutumiseen mikrobisoluihin kalvon läpi, joka sisältää vahamaisen lipidikerroksen, samanaikaisesti fenolin kuumentamisen ja voimakkaan etsausvaikutuksen kanssa. Seoksen myöhempi värjäytyminen 25-prosenttisella rikkihapon tai 3-prosenttisen suolahapon liuoksella johtaa kaikkien ei-happo-nopeiden rakenteiden värjäämiseen. Värien värjääntyneet elementit värjätään 0,3% metyleenisinistä liuoksella. Mykobakteerit eivät näe tavanomaisia aniliiniväriaineita, joiden seurauksena haponkestävät mykobakteerit värjätään karmiininpunertavaksi ja muut mikrobit ja soluelementit - sinisellä.

Ja leviää värjättiin Ziehl-Nelsenu käyttää kevyt kiikari mikroskooppi öljyssä linssi (90- tai 100-kertainen lisäys) ja okulaaria 7- tai 10-kertainen suurennus. Tutki 100 näkökenttää, joka riittää tunnistamaan yksittäiset mykobakteerit. Jos tällaisen tutkimuksen tulos on negatiivinen, vahvistusta varten on suositeltavaa tarkastella 200 näkökenttää. Merkitse tulokset, jotka osoittavat havaittujen haponkestävien bakteerien (KUM) määrän.

Tämän tekniikan lisäksi värinfluorikromeja käytetään luminoivaan mikroskopiaan, mikä mahdollistaa parhaiden tulosten saavuttamisen. Tämän menetelmän käyttö lisää mikroskopian tehokkuutta 10-15%. Kun mykobakteereja hoidetaan luminoivilla väriaineilla (auramiini, rodamiini jne.), Nämä aineet sitoutuvat myös mikrobisolun vahamaisiin rakenteisiin. Säteittäessä värillisiä soluja jännittävällä valonlähteellä (tietty spektri ultraviolettisäteilyä) he alkavat hehkua oranssilla tai kirkkaan punaisella valolla mustalla tai tummanvihreällä pohjalla. Suuren kirkkauden ja kontrastin ansiosta näkyvä kuva voi pienentää mikroskoopin suurennusta 4-10 kertaa, näkökenttä laajenee ja lääkkeen katseluajan lasku. Tämän lisäksi, koska paljon syvyyskenttää, voit lisätä tutkimuksen mukavuutta.

Kun fluoresenssimikroskopiaa käytetään skannaamaan samaa aluetta, tahra kuluu merkittävästi vähemmän aikaa kuin Tsiol-Nelsen-värjäyksen valomikroskooppi. Jos työpäivällä mikroskooppia tutkitaan noin 20-25 tällaista tahraa, sen jälkeen fluoresenssimikroskopian avulla hän voi tutkia yli 60-80 näytettä samanaikaisesti. Kokeneet mikroskoopit tietävät, että solujen väritys auramiinin ja rodamiinin seoksella on jossain määrin spesifinen happo-nopeasti bakteereille, jotka tässä tapauksessa näyttävät kultaisia tikkuja. Saprofyytit maalataan vihertävällä värillä.

Toinen tärkeä etu on menetelmän fluoresenssimikroskopialla - kyky havaita muuttuneita Mycobacterium, menetti vaikutuksen alaisena haitallisia tekijöitä, kuten intensiivinen kemoterapia, kislotousotoychivosti omaisuus ja ei havaita yhteydessä tämän värjäyksen Ziehl-Nelsenu.

Fluoresenssimikroskopian menetelmän haitat sisältävät mikroskoopin suhteellisen korkeat kustannukset ja sen toiminnan. Keskitetyissä tai muissa suurissa laboratorioissa, joissa kuorma ylittää kolmen tavanomaisen mikroskoopin kanssa työskentelevien kolmen laboratoriotekniikan, on halvempaa käyttää sen sijaan yksi fluoresenssimikroskooppi.

Bakteeriskooppisilla menetelmillä on melko suuri spesifisyys (89 - 100%). Noin 97% mikroskoopilla saavutetuista positiivisista tuloksista on yksiselitteisesti vahvistettu kylvämisen tuloksilla.

On huomattava, että kun patologisen aineen hajonta on mikroskooppinen, on mahdotonta määritellä tunnettujen haponkestävien mykobakteerien lajia. Mikroskopia menetelmän avulla antaa lausunto ainoastaan läsnä ollessa tai ilman happoa valmisteen mikro-organismeja, jotka voidaan selittää olemassaolo luonnossa suuri määrä morfologisesti samanlaisia tuberkuloottinen mykobakteerien kompleksi nontubercular happoa resistenttien mikro-organismien.

Mikroskopian tulokset arvioidaan puolikvantitatiivisissa yksiköissä.

Erilaisten mikroskopian menetelmien tulosten vertailemiseksi otetaan käyttöön empiirisiä kertoimia. Esimerkiksi verrata tuloksia leviää värjätty fluoresoivilla väreillä, data tutkimus valomikroskoopilla (1000 kertaisella suurennuksella), on tarpeen jakaa määrä haponkestävien basillien havaita fluoresenssimikroskoopilla, vastaava kerroin 250-kertainen suurennus - 10, 450-kertainen - 4, 630-kertaisesti - 2: een.

Mikroskopian ominaisuudet ylimääräisen tuberkuloosin osalta

Suoramikroskopia suoritetaan sekä rikastuksen jälkeen valmistettujen seosten mikroskooppi, jota seuraa Tsiol-Nelsen-värjäys tai luminesenssivärejä. Suoramikroskopiopäästöt ovat tehottomia johtuen aineen vähäisestä mykobakteerien pitoisuudesta, ja siksi on järkevämpää käyttää rikastusmenetelmiä. Tehokas on sentrifugointi. Jos biologinen materiaali on viskoosi, sentrifugointia samanaikaisesti nesteyttämisen ja homogenointi materiaalia, joka suoritetaan käyttäen suurinopeuksista sentrifugien keskipakovoima 3000 g ja hypokloriittiliuoksia. Muita rikastusmenetelmiä, kuten mikro-flotaatiota, ei tällä hetkellä käytetä biologisten vaarallisten aerosolien muodostumisen vuoksi.

[37], [38],

Tuberkuloosin diagnoosimenetelmä

Kylvämismenetelmä tai viljelymenetelmä on herkempi kuin smekemikroskopia ja sillä on useita etuja jälkimmäiseen verrattuna. Sen avulla voidaan havaita useita kymmeniä elinkykyisiä mykobakteereja testiaineessa ja sillä on suuri diagnostinen arvo. Tämä on erityisen tärkeää tutkittaessa uutta diagnoosia tai hoidettuja potilaita, jotka vapauttavat pienen määrän mykobakteereja.

Verrattuna mikroskopiaan viljelyn tutkimus mahdollistaa yli 15-25 prosentin diagnosoimalla potilaiden tuberkuloosien määrän lisääntymisen sekä tuberkuloosin todentamisen aikaisemmissa vaiheissa, kun tauti on edelleen hoidettavissa. Viljelmätestin erittäin tärkeä etu on mahdollisuus saada exciter-viljelmä, joka voidaan identifioida ja tutkia huumeiden herkkyyden, virulenssin ja muiden biologisten ominaisuuksien suhteen.

Viljelymenetelmien haitat ovat niiden kesto (materiaalien odotusaika on 10 viikkoa). Korkeammat kustannukset, diagnostisen materiaalin käsittelyn monimutkaisuus.

Diagnostiikkamateriaalin käsittelyn periaatteet

Tavanomaisia mikrobiologisia menetelmiä ei voida käyttää tuberkuloosin tutkimusten suorittamiseen. Tämä johtuu siitä. Että mycobacterium tuberculosis kasvaa hyvin hitaasti ja useimmat kliiniset näytteet sisältävät nopeasti kasvavia pyogeenisiä ja putrefaktiivisia mikro-organismeja, sieniä. Niiden nopea kasvu rikkaissa ravinneaineissa häiritsee mykobakteerien kehittymistä ja ei salli tuberkuloosin aiheuttavan aineen eristämistä, joten diagnoosimateriaalia on esikäsitettävä ennen siemennusta. Lisäksi potilaan hengitysteistä vapauttavia mykobakteereita ympäröivät yleensä suuri määrä limaa, mikä vaikeuttaa keskittymis- ta. Tältä osin ennen istutuksen ja muiden vastaavien materiaalien istuttamista, niiden nesteyttämisen, dekontaminaatio on välttämätöntä.

Kaikilla pesuaineilla ja dekontamiineilla on enemmän tai vähemmän voimakasta toksisia vaikutuksia mykobakteereihin. Käsittelyn seurauksena jopa 90% mykobakteereista voi kuolla. Pitää tarpeeksi mykobakteerin väestöstä, säästävät tarvetta käyttää käsittelyä tekniikoita, jotka mahdollistavat, toisaalta, tukahduttaa nopeasti kasvava pyogeeniset bakteerit ja mädäntynyt, ja toisaalta - elinvoimaisuuden säilyttämiseksi mykobakteerien läsnä materiaalissa.

Materiaalista riippuen, sen homogeenisuus ja pilaantumisen esikäsittelyä käyttäen erilaisia puhdistavan: Ysköksen - 4%: ista natriumhydroksidiliuosta, liuokset trohzameschonnogo natriumfosfaattia 10%, bentsalkoniumkloridi, trinatriumfosfaatti, NALC-NaOH: a (N-asetyyli-L-kysteiini natriumhydroksidi), jonka lopullinen pitoisuus on 1%: sta NaOH, virtsan ja muiden nestemäisten aineiden - rikkihappoliuosta 3%, saastuneen näytteet, rasvaa sisältäviä materiaaleja - oksaalihapon 5%. Lisäksi joissakin tapauksissa käytetään entsyymejä, pinta-aktiivisia aineita (pesuaineita). Tweenin ja joidenkin muiden pesuaineiden käyttö aiheuttaa pienemmän mykobakteerisolujen kuoleman (40-50% elossa). Niitä voidaan kuitenkin käyttää vain nestemäisiin materiaaleihin. Maailman suurin jakelu oli NALC-NaOH. Tuotettuina sarjoina. Tällä menetelmällä voidaan jakaa yli 85% mykobakteerisolujen populaatiosta. Kangasta sisältävien kiinteiden materiaalien puhdistaminen on vaikeampaa, koska on vaikea arvata materiaalin hajaantumisastetta homogenisointiprosessin aikana. Esimerkiksi imusolmukkeiden biopsian hoidossa on usein lisääntynyt vieras kasviston kontaminaatiotaajuus. Tällöin voidaan käyttää 1% etonia.

Ei-homogeeninen materiaali homogenoidaan lasihelmillä dekontaminoivien aineiden läsnäollessa. Nestemäiset materiaalit esisentrifugoidaan ja käsitellään vain sakkaa.

Kylvö- ja inkubointitekniikat

Esikäsittelyn jälkeen materiaali sentrifugoidaan, jolloin mykobakteerit saostuvat ja niiden sisältö lisätään sedimentissä ("lietteen rikastus"). Saatu sakka neutraloidaan ja siirrostetaan (siirrostetaan) tiheä ravintoainetta tai putkia nestemäisellä väliaineella. Jäljelle jääneestä sedimentistä valmistetaan smears mikroskooppiseen tutkimiseen. Siemennustekniikan tulisi estää diagnoosimateriaalin ristikontaminaatio.

Mikrobiologisen tutkimuksen tulosten luotettavaa kliinistä tulkintaa varten on noudatettava seuraavaa sääntöä: mikroskooppiset ja viljelmätutkimukset on tehtävä rinnan samasta näytteestä diagnostista materiaalia käyttäen.

Inokuloidut putket sijoitetaan termostaattiin 37 ^° C: ssa 2 päivän ajan vaakasuorassa asennossa. Tämä varmistaa materiaalin tasaisemman imeytymisen viljelyalustaan. Kahden päivän kuluttua putket siirretään pystysuoraan asentoon ja ilmatiiviisti suljetaan kumi- tai silikonipistokkeilla kylvetyn väliaineen kuivumisen estämiseksi.

Viljelykasveja inkuboidaan 37 ^noin C 10-12viikko säännöllisesti viikoittain katseluun. Jokaisesta esikatselusta tallennetaan seuraavat parametrit:

• kylvön kasvun päivästä näkyvä ajanjakso;
• kasvuvauhti (CFU: n määrä);
• satunnaista mikrobifloraa tai sieniä (tällaiset putket poistetaan);
• näkyvän kasvun puute. Putket jäävät termostaattiin seuraavaan katseluun asti.

Ravinnetiedotusvälineet

Mykobakteerien viljelyyn käytetään erilaisia ravinneaineita; tiheä, osittain neste, neste. Mikään tunnetuista ravinneaineista ei kuitenkaan ole ominaisuuksia, jotka varmistavat kaikkien mykobakteeristen solujen kasvun. Tässä yhteydessä on suositeltavaa käyttää 2-3 erilaista koostumusta sisältävää ravintoainetta samanaikaisesti tehokkuuden lisäämiseksi.

WHO suosittelee Levenstein-Jensen -ympäristöä vakiomuotoisena välineenä tuberkuloosin aiheuttavan aineen ensisijaiselle eristämiselle ja sen huumeiden herkkyyden määrittämiselle. Tämä on tiheä munaympäristö, jolla mykobakteerien kasvu saadaan 20-25 päivänä sen jälkeen, kun bakterioskooppisesti positiivinen materiaali on kylvetty. Bakterioskooppisesti negatiivisen materiaalin kasvit vaativat pidemmän inkubointikauden (enintään 10-12 viikkoa).

Maassamme ehdotettu E.R. Finn-munakoira Finn-II. Se eroaa siitä, että se käyttää L-asparagiinin sijaan natriumglutamaattia, joka käynnistää muita tapoja syntetisoida mykobakteerien aminohappoja. Kasvua esiintyy tällä välineellä jonkin verran aiemmin, ja mykobakteerien jakautumistiheys on 6-8% korkeampi kuin Lowenstein-Jensen-alustalla.

Extrapulmonaalisen tuberkuloosin bakteriologisen diagnoosin tehokkuuden parantamiseksi on suositeltavaa sisällyttää muokattuja Finn-II-mediaa ravintoaineiden kompleksissa. Kasvun kiihdyttämiseksi lisätään 0,05% natriumtioglykolaattia, joka vähentää hapen konsentraatiota, Finn-II -ravinteeseen. Mykobakteerien entsyymijärjestelmien suojaamiseksi lipidiperoksidaation myrkyllisiltä tuotteilta Finn-II -ravinteessa lisätään antioksidanttia a-tokoferoliasetaattia pitoisuuteen 0,001 ug / ml. Diagnostiikkamateriaalin kylvö suoritetaan standardimenettelyn mukaisesti.

Venäjän tuberkuloosin vastaisissa laboratorioissa käytetään myös muita tiheän ravintoaineen muutoksia; ehdotettu G.G. Mordovian ravintoalusta "New", jonka on kehittänyt V.A. Aniset ravintoaineet A-6 ja A-9 jne.

Johtuen siitä, että prosessi kemoterapia vaurioita eri aineenvaihdunnan järjestelmien mikrobisolujen, jotkut mykobakteeri väestön menettää kyvyn kehittää normaalisti tavanomaisessa ravinneväliaineessa ja vaatii osmoottisesti tasapainoinen (tai puolittain nestemäiset) elatusaineet.

Diagnostiikkamateriaalin kylvötulosten arviointi ja kirjaaminen

Jotkut mykobakteerikannat ja -lajit kasvavat hitaasti, kasvu voi näkyä jopa 90. Päivä. Tällaisten viljelykasvien määrä on pieni, mutta tämä mahdollistaa kestokyvyn termostaatissa 2,5-3 kk: n ajan.

Mykobakteerin tuberkuloosin virulentti-viljelmät kasvavat yleensä tiheissä munasolosuhteissa erilaisten koon ja lajin R-muotoisten pesäkkeiden muodossa. Pesäkkeet ovat kuivia, ryppyisiä, norsunluutaisia, hieman pigmentoituneita. Muilla tiedotusvälineillä mykobakteerin tuberkuloosin pesäke voi olla kosteampi. Kun kemoterapia jatkuu tai hoidon aikana, sileät, kostealla kasvulla varustetut pesäkkeet (S-muodot) voidaan jakaa.

Kasveja eristettäessä käytetään erityisiä tutkimuksia, joilla erotetaan mycobacterium tuberculosis ei-tuberkuloosista mykobakteereista ja haponkestävistä saprofyteistä.

Positiivinen vaste on annettu, kun värjätty Tsiol-Nelsen -lohko on pakollista mikroskooppista tutkimusta kasvatetuista pesäkkeistä. Kun mykobakteerien kasvua on havaittavissa, havaitaan kirkkaanpunaisia tikkuja, jotka sijaitsevat yksittäin tai ryhmissä, jotka muodostavat klustereita huovan tai punosten muodossa. Nuorilla kulttuureissa, erityisesti eristettyjen pitkäaikaista potilaiden hoitoon kemoterapiaa, mykobakteerien eroavat ilmentynyt polymorfismi, kunnes läsnäolo sauvan muotoinen, sekä lyhyet, lähes kokkoidi- tai pitkänomainen versiot muistuttavat rihmasto.

Mykobakteerien kasvunopeus on osoitettu seuraavalla kaaviolla: (+) - 1-20 cfu in vitro (vähäinen bakteeriperäinen erittyminen); (++) - 20-100 CFU in vitro (kohtuullinen bakteeriperäinen erittyminen); (+++) -> 100 CFU in vitro (runsas bakteeriperäinen erittyminen). Tuberkuloosin laboratoriodiagnoosi ei riitä vastaamaan, onko mykobakteeri havaittu yhdellä tai muulla menetelmällä. On yksityiskohtainen käsitys mykobakteeripopulaation laajuudesta ja luonteesta, sen koostumuksesta ja ominaisuuksista. Nämä tiedot antavat meille mahdollisuuden tulkita oikein prosessin tila, suunnitella taktiikat ja korjata hoito ajoissa.

Viime vuosina mykobakteerien kasvun vauhdittamiseksi on ehdotettu ravintoaineita agar-pohjaisesti erilaisilla kasvun lisäaineilla ja erityisen kaasuseoksen käyttämisellä. Näiden elatusaineiden mykobakteerien kasvun saavuttamiseksi viljelyn aikana syntyy ilmakehää, jossa on suuri hiilidioksidipitoisuus (4-7%). Tätä tarkoitusta varten käytetään erityisiä CO ₂ -moottoreita. Kuitenkin kehittyneimmät automatisoidut mykobakteerien viljelyjärjestelmät: MGIT-BACTEC-960 ja MB / Bact.

Eräs tällainen järjestelmä - MGIT järjestelmä (mykobakteerien kasvu osoittaa, putki), joka viittaa kehittäminen korkean teknologian ja on tarkoitettu nopeaan bakteeri- todettu tuberkuloosi ja Mycobacterium alttius ensilinjan lääkkeitä, ja jotkut toisen linjan lääkkeitä. MGIT keskittyy käyttämään sitä osana VASTES-960-laitetta. Mikro-organismeja viljellään erityisissä putkissa, joissa on nestemäistä ravintoalustaa, joka perustuu modifioituun Middlebrook-7H9-väliaineeseen. Mykobakteerien kasvun stimuloimiseksi ja ulkomaisen mikrofluorin kasvun hillitsemiseksi käytetään MGIT Growth Supplementa ja PANTA-bakteerilääkkeiden seosta.

Mikro-organismien kasvu kirjataan optisesti. Se perustuu fluoresenssiin, joka ilmenee, kun mykobakteereista kuluttaa happea kasvun aikana. Happi-riippuvainen fluorokromi-väriaine löytyy erityisen koeputken pohjasta ja peitetty silikonikerroksella. Lisääntymiselle mykobakteerit johtaa vähenemiseen hapen määrä putken ja vähentäen konsentraatio, joka aiheuttaa fluoresenssin nousu, joka muuttuu näkyväksi säteilytettäessä ultraviolettivalolla putkien ja rekisteröidään automaattisesti valoanturin sisäänrakennettu laite VASTES-960. Luminesenssin intensiteetti kirjataan kasvuyksiköihin (GU-kasvuyksiköt). Kasvatustiedot tallennetaan tietokoneeseen, jossa ne voidaan tallentaa automaattisesti. Tietotekninen analyysi kasvukäyrät voi antaa tietoa läsnäolo erilaisia Mycobacterium allasta, joista nontubercular, ja auttaa myös arvioimaan kasvun ominaisuuksien mykobakteerien.

Näiden järjestelmien käyttöönoton myötä mykobakteerien kasvun aika laski merkittävästi, keskimäärin 11 vuorokautta VASTES-960: lla ja 19 päivällä MB / Bact: lla verrattuna 33 vuorokauteen tavallisella tiheällä ravintoalustalla. On huomattava, että nämä järjestelmät edellyttävät erittäin pätevää henkilöstöä. Materiaalin kylvöä nestemäisissä väliaineissa seuraa välttämättä kylvö Levenstein-Jensen -alustalla, joka on duplikaattorin rooli niissä tapauksissa, joissa mykobakteerin tuberkuloosi ei aiheuta muita väliaineita.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Mykobakteerien lääkeherkkyyden määrittäminen

Mykobakteerien spektrin ja herkkyyden määrittäminen tuberkuloosilääkkeille on erittäin kliinistä, samoin kuin tuberkuloosin leviämisen epidemiologinen arviointi huumeidenkestävyydellä. Lisäksi huumeidenkestävyyden seuranta mahdollistaa tuberkuloosi-ohjelman tehokkuuden arvioinnin kokonaisuutena, joka on integroitu indikaattori tuberkuloosin torjuntaan liittyvien kaikkien komponenttien suorituskyvystä.

Lääkkeen herkkyyden moninaisuus ja ajoitus:

• ennen hoidon aloittamista kerran hoidon strategian ja taktiikan määrittämiseksi:
• kun eristetään erilaisista materiaaleista (ysköstä, BAL-nesteestä, virtsasta, eritteistä, lipeistä jne.) sairastuneista viljelmistä, kaikki eristetyt kannat tutkitaan:
• hoidon intensiivisen vaiheen päätyttyä kliinisen ja radiologisen dynamiikan puuttuessa:
• jos hoito-ohjelmaa on tarpeen muuttaa seuraavissa tapauksissa:
  • luntautuman puuttuminen;
  • viljelmän eristäminen uudestaan itkuun kohdistuneen negatiiviselta;
  • CMB: n lukumäärän voimakas kasvu swabissa alkuperäisen laskun jälkeen. Tiedetään hyvin, että mykobakteerin tuberkuloosikannat, jotka ovat heterogeenisiä lääkeherkkyyden suhteen, eristetään tuberkuloosin potilaasta. Kantojen herkkyys tuberkuloosilääkkeille voi vaihdella lääkeaineiden, asteen, esiintymistiheyden ja resistenssin esiintymisnopeuden välillä.

Aste lääkeresistenssin Mycobacterium tuberculosis määritettiin mukaisesti asetetut kriteerit, jotka ovat keskittyneet kliinistä merkitystä ja vakaus riippuvat aktiivisuutta anti-TB lääke, sen farmakokinetiikka, pitoisuus vaurion. Maksimi terapeuttinen annos ja niin edelleen.

Mykobakteerien lääkeherkkyyden määritys suoritetaan tällä hetkellä mikrobiologisilla menetelmillä:

• Absoluuttiset pitoisuudet (laimennusmenetelmä tiheälle tai nestemäiselle ravintoaineelle),
• mittasuhteet,
• vastuskerroin.

Yleensä resistenssi ilmentyy mykobakteerin tuberkuloosin pesäkkeiden visuaalisesti havaitun kasvun muodossa, mutta on olemassa menetelmiä, jotka indusoivat kasvua mykobakteerien solujen jakautumisen alkuvaiheissa värireaktioiden muodossa. Nämä menetelmät lyhentävät testiaikaa 3-4: stä 2 viikkoon.

Unified Venäjällä on jatkettu, WHO suosittelee komitean kemoterapiamenetelmä absoluuttisten pitoisuuksien, mikä on Metodologisesta näkökulmasta, on yksinkertainen, mutta se vaatii suurta tarkkuutta ja standardointia laboratoriomenettelyt. Lääkeherkkyyttä koskeva koe koostuu joukosta koeputkia, joissa on ravintoalusta, joka on modifioitu anti-TB-lääkkeillä. Joukko koostuu 2-3 putkien eri pitoisuuksilla kunkin huumeita käytetään, yksi kontrollikoeputkissa ilman lääkettä ympäristöön ja toinen putki, joka sisälsi 1000 ug / ml natrium- Sali tsilovokislogo tai 500 ug / ml paranitrobenzoynoy happo nontubercular kasvun havaitsemiseksi mykobakteerien.

Valmistettavien väliaineiden valmistamiseksi käytetään muunneltua Levenstein-Jensen-väliainetta (ilman tärkkelystä), joka kaadetaan pulloihin. Kussakin pulloissa lisätään tietty määrä antituberkuloosista valmistettua sopivaa laimennusta. Pulloiden sisältö sekoitetaan perusteellisesti, kaadetaan putkiin ja taitetaan kaltevassa asennossa 40 minuutin ajan 85 ° C: n lämpötilassa. On suositeltavaa kierrättää väliaine sähköisellä uudelleenkelaajalla automaattisella lämpötilan säätöllä. Keskiviikkona anti-TB-huumeiden kanssa

1-sarjan sarja voidaan säilyttää jääkaapissa 2-4 ° C: ssa 1 kuukauden ajan, toisen rivin valmisteilla - enintään 2 viikkoa. Säilytys väliaineiden kanssa huoneenlämpötilassa oleville valmisteille ei ole hyväksyttävää. Tuberkuloosilääkkeiden liuoksia valmistettaessa otetaan huomioon niiden aktiivisuus laskemalla pitoisuus, joka on säädetty valmisteen epäspesifisen osan, puhtauden jne. Molekyylipainon perusteella. Lääkkeen herkkyyden määrittämiseksi käytetään vain kemiallisesti puhtaita aineita.

Menetelmän periaate on määritellä antituberkuloottisen lääkeaineen pitoisuus, joka estää merkittävän osan mykobakteeripopulaation kasvua. Jos tämä on tehty oikein, menetelmällä on hyvä luotettavuus.

Ennen testiä on varmistettava, että mikobakteerin tuberkuloosin eristetyssä viljelmässä ei ole vierasta mikrofloraa. Mykobakteerien viljelmästä 0,9% natriumkloridiliuoksessa valmistetaan homogeeninen suspensio, joka sisältää 500 miljoonaa mikrobikappaletta / ml (optinen sameusstandardi, 5 yksikköä). Tuloksena oleva liete laimennetaan 0,9-prosenttisella natriumkloridiliuoksella (1:10) ja 0,2 ml lietettä lisätään jokaiseen viljelyväliaineputken putkeen. Siemennetyt putket sijoitetaan termostaattiin 37 ° C: ssa ja pidetään vaakasuorassa asennossa 2-3 päivää siten, että viljelyväliaineen kalteva pinta on inokuloitu tasaisesti mykobakteerin tuberkuloosin suspensioon. Putket siirretään sitten pystyasentoon ja inkuboidaan 3-4 viikkoa. Tulokset kirjataan 3-4 viikon kuluttua.

Koska ajoitus aineen vapautumisen kliinistä materiaalia ravintoalustalla muodostavat vähintään 1-1,5 kuukautta lääkeaineen herkkyys voidaan saada tällä menetelmällä ei ole aikaisempi kuin kuluttua 2-+2,5kuukautta ymppäyksen jälkeen materiaali. Tämä on yksi menetelmän tärkeimmistä haitoista.

Tulkita tuloksia mykobakteerien lääkeherkkyyden määrittämiseksi tiettyjen kriteerien perusteella. Kiinteällä elatusaineita pidetään herkkä lääkkeen pitoisuus, joka sisältyy väliaineessa, jos pesäkkeiden lukumäärä mykobakteerien kasvatetaan in vitro tätä lääkettä ei ole enemmän kuin 20 runsaasti kasvun säätöputken ilman lääkkeitä. Vain yli 20 pesäkkeen läsnä ollessa on kulttuuria, jota pidetään tämän pitoisuuden vastustuskyvänä. Käytännössä kasvu saavuttaa koeputkista lähes 20 cfu. On välttämätöntä ilmoittaa kliiniselle yksikölle, että herkkyys tai vastustuskyky tässä tapauksessa on raja-arvo, koska se voi joskus selittää kliinisten indikaattorien sumean dynamiikan.

Eri lääkeaineille muodostetaan tietty pitoisuus, jossa havaitaan mykobakteeripopulaation kriittisen osuuden lisääntymistä. Näitä pitoisuuksia kutsutaan "kriittiseksi". Stabiilisuuden kriteerinä käytetään mykobakteerien populaation kasvua ravintoalustassa, jossa käytetään valmistetta kriittisellä pitoisuudella.

Kotimaisessa TB-käytännössä lääkeaineiden vastustuskyvyn määrittämisessä niitä ei ole rajoitettu määrittämään vain kriittiset pitoisuudet. Tämä johtuu siitä. Että laajempi määritelmä tason lääkeresistenssin avulla lääkäri voi paremmin sijoittaa joukkueen kemoterapia käyttäen tietoa voimistamaan lääkeaineen yhdistelmiä, ristikkäin odotetaan resistenssin tai soveltaa tehokkaampia lääkkeitä ryhmä, jota käytetään anti-TB huumeita.

Absoluuttinen pitoisuusmenetelmä on yksinkertaisin, mutta se on myös kaikkein herkin virheiden suorittamisen aikana. Menetelmämuoto on luotettavampi erityisesti määritettäessä herkkyyttä toissijaisille lääkkeille ja yhteistä Venäjän ulkopuolelle. Se ottaa huomioon absoluuttisten pitoisuuksien menetelmän puutteet, mutta toteutuksessa se on työläämpi.

Menetelmä on hyvin samanlainen kuin absoluuttinen pitoisuusmenetelmä. Koeputkien valmistus lääkkeillä suoritetaan samalla tavalla. Kuten absoluuttisessa konsentraatiomenetelmässä. Mycobacterium tuberculosis -suspension siemensyytti kuitenkin vähenee kertoimella 10. Joka poistaa tiettyjen mykobakteerin tuberkuloosin kantojen spontaanin resistenssin esiintyvyyden sellaisiin lääkkeisiin kuin Etambutol, protionamidi, capreomysiini. Kontrollina käytetään 2 tai 3 putkea, joiden siemenannos on yhtä suuri koeputkissa, peräkkäin laimennettuna 10 ja 100 kertaa. Stabiilisuuskriteeri on mykobakteerin tuberkuloosin visuaalisesti havaitun kasvun osuus. Ensimmäisen sarjan lääkkeissä stabiilisuuskriteeri on kasvun ylimäräisyys, joka on 1% alkuperäisestä populaatiosta, toisen rivin lääkkeissä - lisäys on 1 tai yli 10% alkuperäisestä, riippuen valitusta kriittisestä pitoisuudesta.

Vuonna 1997 työryhmä WHO: n ja Kansainvälisen liiton hyvien tuberkuloosin TB lääkeresistensseihin on tehnyt oikaisut näihin kriteereihin, jotka tarjoavat katsottiin olevan resistenttejä mykobakteerit, jotka kasvavat kiinteää muna median Lowenstein-Jensen seuraavilla pitoisuuksilla:

• dihydrostreptomysiini - 4 ug / ml;
• isoniatsidi 0,2 ug / ml:
• rifampisiinin 40 ug / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

Vuonna 2001 ehdotettiin kriittisiä pitoisuuksia seuraaville toissijaisille lääkkeille (kriittiselle 1 prosentin osuudelle):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protonamidi - 40 mcg / ml;
• kanamysiini - 30 ug / ml;
• viomysiini - 30 mcg / ml;
• cycloseriini 40 ug / ml;
• aminosalisyylihappo - 0,5 ug / ml;
• ofloxasiinia - 2 μg / ml.

Kasvutuloksia arvioidaan 4 viikon kuluttua alustavana ja 6 viikon viljelyn jälkeen - lopullisena.

Lääkkeen herkkyyden määrittämiseksi pyratsinamidille, jota käytetään nykyaikaisessa tuberkuloosin kemoterapiaan, suositeltu kriittinen pitoisuus on 200 μg / ml. Kuitenkin tähän mennessä ei ole yleisesti hyväksyttyä menetelmää huumeidenkestävyyden määrittämiseksi tätä lääkettä varten kiinteään ravintoaineeseen, koska sen antibakteerinen aktiivisuus ilmenee vain happamassa väliaineessa (pH <6), mikä on teknisesti vaikeata ylläpitää. Lisäksi monet mykobakteerien tuberkuloosin kliiniset viljelmät kasvavat vastahakoisesti munasolosuhteissa, joissa on hapanta ympäristöä.

Laadun arvioimiseksi tulosten lääkeherkkyysmenetelmien testaus Mycobacterium, suositellaan, että jokainen uusi erä väliainetta LJ ohjata rinnakkain määrittämiseksi herkkyys standardin museon H37Rv-kannan. Lisäksi on olemassa tiettyjä mikrobiologisia kriteerejä, jotka on säilytettävä siten, että tekniikoilla saadaan aikaan hyvin toistettavissa oleva ja oikein tulkittu tulos. Näitä ovat elinkelpoisuus Mycobacterium tuberculosis, säännöt suspensio on tasainen ja suspensioviljelmiä valinta sääntöjen Mycobacterium tuberculosis, edustavuus valittu bakteeri- massa. Lääkeherkkyyden määrityksen luotettavuus vähenee erittäin vähäisellä bakteerivapautuksella.

Viime aikoina on pidetty lupaavana menetelmää huumeiden herkkyyden määrittämiseksi automatisoiduilla järjestelmillä. Täydellisimmät tällä alalla ovat VASTES MGIT-960: n perustuvat kehitystyöt. Tässä tapauksessa mykobakteerin tuberkuloosin huumeiden herkkyys määritetään muunnetun metsämenetelmän perusteella. Määritysprosessissa verrataan mycobacterium tuberculosis -kasvuprosenttia kontrolliputkessa ja lääkeaineiden koeputkissa. Määrittää herkkyys streptomysiini, isoniatsidi, riutta-pitsinu ja etambutoli on käytetty rikastuttavat lisäaineita ja antibiootteja sisältyy joukko SIRE kit. Herkkyyden määrittämiseksi pyratsinamidille käytä PZA-pakkausta. Aikana suspension testi Mycobacterium tuberculosis siirrostettiin koeputkeen, jossa lääkkeitä, sekä ohjaus putket saatettua suspensiota 100 kertaa kaikkien huumeiden paitsi pyratsinamidi, jossa suspensio on laimennos 10 kertaa. Stabiilisuuskriteeri on 100 GU: n mykobakteerien kasvuindikaattori, kun kasvua on saavutettu kontrolliputkessa 400 GU (katso "Kulttuurimenetelmät mikobakteerien eristämiseksi"). Tulosten kirjanpito ja tulkinta suoritetaan automaattisesti ja ne asetetaan syöttöllä tai valitulla ohjelmalla.

Kriittisinä pitoisuuksina käytetään lopullisia pitoisuuksia testiputkessa nestemäisen ravintoalustan kanssa. Tällä hetkellä kriittisiä pitoisuuksia on kehitetty sekä ensimmäisen että toisen linjan lääkkeille. On huomattava, että mykobakteerien tuberkuloosin herkkyys sykloseriinille ja aminosalisyylihapolle määritetään vain munan ravintoaineilla.

Kehittää työn kuvatun protokollan mahdollistaa tutkimuslääkkeeseen herkkyys omistettu kulttuuri (tiheä ravintoalustaa), ja käyttäen ensisijaisena Mycobacterium MGIT-kasvua in vitro. Jälkimmäinen vaihtoehto merkittävästi vähemmän aikaa kulttuurin, jolloin voit saada täyden tulokset Mycobacterium tuberculosis (mukaan lukien tiedot lääkeherkkyys) 3 viikon kuluttua siitä päivästä, kokoelma materiaalin, vaikka perinteinen menetelmä on mahdollista saada vain 3. Kuukausi. Ajoittain saadut tulokset, kun potilas on hoidon intensiivisessä vaiheessa, voi kompensoida suhteellisen korkeat tutkimuskulut.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Mykobakteerien erilaistaminen

Ottaen huomioon, että käytetyt ravintoaineet eivät ole tiukasti valikoivia. Erillisten mykobakteerien myöhempi erottelu tunnustetaan pakolliseksi. Tarve eriyttää mykobakteerien johtuu useita ominaisuuksia patologisten prosessien aiheuttama suvun: eri kurssi ja tulokset tuberkuloosin ja mykobakterioosi, läsnäolo luonnollista lääkeresistenssin joitakin anti-TB huumeita.

On selvää, että ensisijainen tunnistaminen Mycobacterium tuberculosis M. Nontubercular mykobakteereita suoritetaan seuraavat ominaisuudet: kasvu kiinteällä ravintoalustalla, pigmentti, pesäkkeen morfologian, hapon läsnä ollessa vastus ja lämpötila optimaalinen kasvu.

Valitettavasti ei ole olemassa yhtä laboratoriomenetelmä luotettavasti erottaa M. Tuberculosis mykobakteerit muiden happo-basillien kuitenkin yhdistelmä edellä kuvattuja piirteitä ja tulokset annetaan alla useita biokemiallisia testejä voidaan tunnistaa Mycobacterium tuberculosis M. Todennäköisesti 95%.

Erilaistumiseen Mycobacterium kompleksin M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii ja muut) päässä hitaasti kasvavat mykobakteerit käytetään nontubercular perus- biokemialliset testit, jotka havaitsevat läsnäolo seuraavista oireista:

• kyky tuottaa nikotiinihappoa (nasiinitesti):
• nitraattireduktaasiaktiivisuus;
• lämpöstabiili katalaasi;
• kasvu keskipitkällä natriumsalisylaatilla (1 mg / ml).

Lisätesteinä voidaan myös käyttää kasvua elatusaineella, joka sisältää 500 ug / ml paranitrobentsoehappoa tai 5% natriumkloridia.

Monet bakteriologiset laboratoriot tunnistavat nämä mikro-organismit vain kompleksin tasolla, mikä johtuu laboratorioiden rajoitetuista ominaisuuksista ja asiantuntijoiden metodologisista valmiuksista.

Useimmissa tapauksissa kuitenkin käytännössä erottaa M. Tuberculosis ja M. Bovis on riittävä seuraavat testit: niasiinia, läsnäolon nitraatti, läsnä rekisteröinti ja pirazinamidazy elatusaineessa, joka sisälsi 2 ug / ml hydratsidi tiofeeni-2-karboksyylihappo. Otetaan huomioon, että M. Tuberculosis -kompleksin mykobakteereille on tunnusomaista seuraavat merkit:

• hidas kasvu (yli 3 viikkoa);
• kasvulämpötila välillä 35 - 37 ^° C;
• pigmentoinnin puuttuminen (norsunluu);
• merkitty happo-nopea väri;
• positiivinen niasiinitesti;
• positiivinen nitraattireduktaasikoke;
• termostabilisen katalaasin puuttuminen (68 ^° C).
• Kasvun puuttuminen Levenstein-Jensen -alustalla, joka sisälsi:
  • 1000 ug / ml natriumsalisylaattia,
  • 500 ug / ml paranitrobentsoehappoa,
  • 5% natriumkloridia:
• kasvua läsnä ollessa 1-5 ug / ml tiofeeni-2-karboksyylihappoa.

Eriytettyjen mykobakteerien erilaistumisen merkitys kasvaa merkittävästi tuberkuloosin tai mykobakteerin aiheuttamien hiv / aids-tapausten tallentamisen tiheyden kasvaessa. Tällä hetkellä ei ole olemassa absoluuttista varmuutta käytännön alueellisten laboratorioiden valmiudesta suorittaa tätä työmäärää oikein.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Tuberkuloosin immunologinen diagnoosi

On olemassa useita yleisiä ilmiöitä, lääkkeitä ja immunologisia testejä, jotka alun perin todettiin juuri tuberkuloosilla tai mykobakteerien immuunivasteen mallilla. Näitä ovat BCG tuberkuliini, tällainen ilmiö kuten ihon DTH (tuberkuliini - Pirquet ja Mantoux'n reaktio), reaktio ihonalainen tuberkuliinin herkistetty eläimet (Koch-ilmiö). Yksi ensimmäisistä tartuntatautien vasta-aineista havaittiin myös tuberkuloosissa. Tietenkin syvempää ymmärrystä hyvän tuberkuloosin immuniteettimekanismien ja geneettisen ohjaus, sitä suurempi voi olla käyttöä immunologisia menetelmiä ja lääkkeitä, jotka vaikuttavat immuunijärjestelmään, käytännön ongelmien ratkaisemiseksi TB.

Tärkein ja vaikea käytännön ongelma on tällä hetkellä katsottava tuberkuloosin toteamiseksi väestön massasuunnitteluprosessissa. Huolimatta lukuisista "menestyksistä" (rajoitetuista aineista) kerto- muksista huolimatta ei ole olemassa sopivaa immunologista menetelmää (joka voidaan toistaa mistä tahansa käsivarresta) ja tähän tarkoitukseen sopivaa lääkettä.

Immunologisia menetelmiä, erityisesti serologisia tutkimuksia (antigeenien, vasta-aineiden määrittäminen) ja tuberkuliinista herättäviä testejä käytetään hyvin laajasti kliinisessä käytännössä.

Erotusdiagnoosissa käytettyjen immunologisten tutkimusten joukossa on serologisia menetelmiä - antigeenien ja vasta-aineiden määrittäminen eri elinympäristöissä.

Mykobakteerien tuberkuloosi-vasta-aineiden spesifisyys riippuu immunoanalyysissä käytetyistä antigeeneistä. Merkittävää määrää antigeeneja ehdotetaan, joista ensimmäinen on tuberkuliini PPD:

• PAP ja muut kompleksiset valmisteet viljelynesteestä;
• ultraääni hajoaminen;
• Triton-uute ja muut soluseinien monimutkaiset valmisteet;
• 5-antigeeni (Daniel);
• 60-antigeeni (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• johto-tekijä (trehaloosi-6,6-di-mykolaatti);
• fenoli- ja muut glykolipidit;
• lipopolysakkaridi;
• fibronektiiniä sitova antigeeni;
• proteiinit (useimmiten rekombinantti); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA jne.

Seurauksena vuoden tutkimuksen Venäjän ja ulkomaisten tutkijat ovat paljastaneet peruslakeja ja vasta-aineen tehokkuutta serologinen diagnoosi tuberkuloosi monimutkaisempi antigeeni, sitä suurempi herkkyys ja alempi testin spesifisyyttä. Spesifisyys eri maissa vaihtelee väestöstä M. Tuberculosis -infektion ja nontubercular mykobakteerit kuljettaa BCG-rokotteen ja muut. Lapsilla, tietosisältöä serodiagnoosiin on pienempi kuin aikuisilla. Ensisijaisessa tuberkuloosissa (useimmiten lapsilla) IgM: n määritelmä on informatiivisempi. Toissijaisella IgG: llä. HIV-infektoituneissa potilailla serodiagnoosin informatiivinen arvo vasta-aineiden määrittämisessä vähenee. Tehokkuus vasta-aineiden määrittämiseen riippuu siitä, kuinka monta "kliinisen näkökohdat": menetelmä aktiivisuus (läsnäolo tai puuttuminen "eristäminen" mykobakteerien läsnäolon rappeutuminen onteloita, aste tunkeutumisen), esiintyvyys prosessin kesto sen virtausta.

Entsyymi-immunoanalyysimenetelmän (ELISA) herkkyys on noin 70%. Tutkimuksen riittämätön tehokkuus johtuu sen alhaisesta spesifisyydestä. Aikaisemmin tarkasteltiin mahdollisuutta käyttää serologista seulontaa suuririskisillä ryhmillä, erityisesti keuhkoissa tapahtuneiden tuberkuloosin jälkeisten henkilöiden välillä.

ELISA: n spesifisyyden lisäämiseksi etsii tarkempia antigeenejä, mukaan lukien geenitekniikan avulla saadut: ESAT-6, jne. (Ks. Edellä). Tiukasti spesifisten antigeenien (38 kDa, ESAT) käyttö lisää spesifisyyttä. Mutta vähentää merkittävästi analyysin herkkyyttä. Yhdessä IFA (kokeellinen laboratoriokoe järjestelmiä. Esim Pathozyme ELISA-kittiä) on myös sarjat sivusuunnassa immunokromatografisen suodattamalla (Mycodot), samoin kuin muita samankaltaisia testejä (piste-analyysi kalvon) visuaalisen arvioinnin tulos. Näiden testien aikana analyysi suoritetaan 10-30 minuuttia; he eivät vaadi erityisiä laitteita, he tarvitsevat visuaalista tulosten arviointia, joka liittyy tiettyyn subjektiivisuuteen. Näillä menetelmillä on suunnilleen sama herkkyys- ja spesifisyysominaisuudet (70% ja 90-93% vastaavasti) kuin perinteinen ELISA.

Immunologisen analyysimenetelmien käytöllä on määritetty lisäarvo, joka on otettu huomioon käytettävien menetelmien monimutkaisuudessa tuberkuloosin erilai- sen diagnoosin aikana, erityisesti sen ylimääräisten muotojen diagnosoinnissa. Tehokkain ELISA-menetelmä on tuberkuloosin aivokalvontulehduksen diagnosoinnissa aivo-selkäydinnesteessä. Tässä tapauksessa analyysin herkkyys on 80-85% ja spesifisyys 97-98%. On tietoja tuberkuloottisen uveiitin diagnoosissa mykobakteerien tuberkuloosin vasta-aineiden havaitsemisen tehokkuudesta kyynelnesteessä.

Induction of gamma interferon synteesi in vitro

Gamma-interferoni (IFN-y) on spesifinen immuunipuolustekijä, joka toteutetaan aktivoimalla makrofagien entsyymijärjestelmiä. Herkistettyjen T-lymfosyyttien IFN-y-synteesin indusoiminen aiheuttaa niiden vuorovaikutuksen mykobakteerien antigeenien kanssa.

Koska antigeeniä käytetään tuberkuliinina PPD. Ja antigeenit on saatu geenitekniikalla, erityisesti antigeenien ESAT-6 (varhainen erittää antigeeni, jonka molekyylipaino 6 kDa) ja CFP-10 (viljelmän suodoksesta proteiini 10 kDa). Geneettinen tekniikka tai rekombinanttiantigeenit puuttuvat BCG-rokotteen soluista ja muista mykobakteereista. Tuberkuliinihoitoa käytettäessä induktiokokeiden IFN-y tulokset ovat verrattavissa tuberkuliinin ihokokeiden tuloksiin (suora korrelaatio). Kun käytetään geneettisesti muokattuja antigeenejä, testitulokset ovat tarkempia eivätkä ne riipu BCG: n edellisestä rokotuksesta. Testattaessa rokotettuja henkilöitä, joilla ei ole ollut yhteyttä tuberkuloosi-infektioon, testin spesifisyys on 99%. Testin herkkyys potilaiden tuberkuloosissa vaihtelee 81: stä 89 prosenttiin.

Testejä ja diagnostisia työkaluja on kehitetty perustuen lyhyen aikavälin solujen viljelyyn tai koko veren mononukleaarisia soluja eristettiin verestä antigeenien kanssa Mycobacterium tuberculosis in vitro ja sitä seuraava määritys IFN-γ-pitoisuus tai laskemalla T-lymfosyyttien, jotka syntetisoivat IFN-γ. Pitoisuus interferoni oli syntetisoitu in vitro määritettiin ELISA: lla käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita sitova IFN-γ. Sitten standardisoidun IFN-y: n kalibroimalla sen pitoisuus määritetään levyn koeputkessa tai kuopissa.

Kun suoritetaan Elispot-testi, IFN-y: n syntetisoivien T-limosyyttien määrä. Lasketaan IFN-y: n vasta-aineiden kanssa päällystetyn levyn pinnalle.

Kehittäjät Diagnosticum IFN-γ in vitro induktion kautta, joka on hyväksytty lääkevirasto US tuotteita, väittävät, että testi on mahdotonta erottaa toisistaan latenttia TB tartunnan aktiivinen tuberkuloosi. Siksi alueilla, joilla on suuri infektion taso, testi ei ole suoraan diagnoosi. Maassamme sitä voidaan kuitenkin käyttää erottamaan tuberkuloosi-infektio lapsilla rokotuksen jälkeisestä allergiasta ja arvioimaan erityisominaisuuden taso hoitoprosessissa.

Tällä hetkellä tutkitaan kotimainen testijärjestelmä IFN-y-synteesin induktiomäärityksen määrittämiseksi spesifisillä tuberkuloosi-antigeeneillä in vitro.

Immuunijärjestelmä ja tuberkuloosin kulku, immunokorjaus

Tuberkuloosin hoidossa ihmisillä on muutoksia antigemeeassa ja immuunijärjestelmän tilassa.

Lähtöaineiden ja kudosten muutokset ovat suurelta osin ristiriitaisia. Ainoa asia, joka voidaan havaita hyvällä syyllä, on se, että tuberkulaarisissa granulomeissa havaitaan tavallisesti huomattava määrä aktivoituja T-lymfosyyttejä.

On järkevää viitata kahteen muuhun määräykseen, jotka ovat välttämättömiä immunologisten mekanismien merkityksen ymmärtämiseksi tuberkuloosin hoidossa ihmisillä:

• Aids-potilailla on erityisen korkea esiintyminen monissa lääkeaineiden resistenssissa;
• (ja HIV-infektion puuttuessa) immuniteettihäiriöt (erityisesti T-solulinkki) ovat erityisen merkittäviä.

Kun tuberkuloosi laajalti soveltaa eri menetelmiä immunomodulaatiota: se on ensisijaisesti vaikuttavia lääkeaineita ensisijaisesti T-soluimmuniteetin ja järjestelmä mononukleaaristen fagosyyttien (kateenkorvahormoneista, isoforoni, likopid, polioksidony et ai.). Samoin kuin koko (heikennetyt) mykobakteerit ja niiden komponentit.

Tuberkuloosin molekyyli-biologinen diagnoosi

Molekyylibiologian menetelmiä infektiotautien diagnosointiin ovat pääasiassa perustuvat menetelmät manipuloimalla kanssa genomisen aineen bakteeri- ja viruspatogeenien tunnistaa tietyn geneettisen materiaalin - DNA-segmenttejä, jolla on nukleotidisekvenssi, joka on spesifinen tietyn tyyppisen tai patogeenin kantoja analysoida erityisiä DNA-sekvenssit geeneissä, jotka määrittävät taudinaiheuttajan herkkyyden tiettyihin lääkeaineisiin ja myös funktionaaliseen analyysiin taudinaiheuttajien tiettyjen geenien aktiivisuutta. Molekyylibiologian tekniikoita olivat laajasti tieteellisessä tutkimuksessa ja käytännön soveltamista, diagnosointiin ja seurantaan eri bakteeri- ja virusinfektioiden avaamisen jälkeen vuonna 1985, Carrie Myullisom (Nobelin palkinnon. 1989) polymeraasiketjureaktion.

Polymeraasiketjureaktion menetelmien periaatteet ja mahdollisuudet

PCR mahdollistaa nukleotidisekvenssin monistumisen (lisääntymisen) in vitro (patogeenin DNA-fragmentti) useita tunteja miljoonien kertojen ajan. Reaktio yksittäisten DNA-ketjujen läsnä ollessa määrää määrityksen erittäin korkean herkkyyden.

DNA-ketjun tiettyjen alueiden nukleotidisekvenssi määrittää mikro-organismin geneettisen identiteetin, mikä selittää PCR: n korkean spesifisyyden.

Arvo tämän tekniikan havaitsemiseksi ja tutkimiseksi ominaisuuksien Mycobacterium tuberculosiksen aiheuttama biologiset ominaisuudet mikro-organismin, jolla erittäin hidas kasvu kaksinkertaistaminen aika Mycobacterium tuberculosis DNA, kun viljely on 12-24 tuntia.

PCR-menetelmän periaate koostuu monistamisesta - useita, miljoonia kertoja. Kerrotaan tietyn DNA-sekvenssin osuudet putken mikrovolumeissa seuraavan kolmen reaktiovaiheen syklisen toistumisen aikana, joista kukin kulkee eri lämpötilajärjestelyissä:

• Kaksoisjuosteisen DNA: n vaiheen I denaturointi kuumennettaessa sen ketjujen eroavuudet;
• II-vaihe - komplementaarinen sitoutuminen (hybridisaatio) alukkeiden (primäärioligonukleotidit) kanssa tiukasti spesifisten ketjujen pääteosat, jotka on valittu DNA-fragmentin monistamiseksi;
• Vaihe III - DNA-fragmentin ketjun loppuun saattaminen käyttäen termostabiilia DNA-polymeraasia.

In vitro -vahvistuksessa on oltava matriisi-DNA: n molekyylejä. Neljä tyyppistä deoksinukleosiditrifosfaattia (nukleotidit), jotka sisältävät vastaavat typpipitoiset emäkset: adeniini (A), tymiini (T), guaniini (D), sytosiini (C); keinotekoisesti syntetisoituja alustavia oligonukleotideja (alukkeita), jotka koostuvat 18-20 emäsparista; lämpöstabiilin DNA-polymeraasin, jonka lämpötilaoptimi on 68-72 ^on C, ja magnesiumioneja.

PCR: n spesifisyys riippuu DNA-fragmentin valinnasta. Tämän mukaisesti syntetisoidaan kyljen siemenet oligonukleotidit. DNA-ketjun hybridisaation ja täydentymisen erityisyys johtuu seuraavien typpipitoisten emäsparien komplementaarisuuden periaatteesta: adeniini-tymiini, guaniini-sytosiini.

Määrittää genomisen tuberkuloottinen mykobakteerien kompleksi tehokkain kohteen monistuminen useimmissa testijärjestelmissä valittu DNA-fragmentti IS6110, joka useimmissa Mycobacterium tuberculosis -genomin on merkittävä määrä (10-20) toistoja, joka tarjoaa yhdessä spesifisyys, korkea herkkyys määrityksessä. Samanaikaisesti kuvataan Mycobacterium tuberculosis -kantoja, joilla on pieni määrä toistoja tai IS6110-fragmentin puuttumista.

DNA-molekyylien eristäminen biologisesta näytteestä

PCR: n suorittamiseksi patogeenin DNA-molekyylit tulisi eristää biologisesta materiaalista minimaalisella tilavuudella, jolloin vähimmäismäärä ei-spesifistä DNA: ta ja erilaiset entsyymi- DNA-polymeraasin estäjät.

Näytteiden valmistaminen olisi suoritettava olosuhteissa, jotka estävät eristettyjen DNA-molekyylien näytteiden ristikontaminaation. Tällöin huoneen esikäsittely ultravioletti-, lattiat ja työpöytien kanssa on tarpeen klooripitoisten liuosten kanssa. Myös puhtaiden käsineiden, kertakäyttöisten koeputkien ja vinkkien pakollinen käyttö automaattisiin pipetteihin.

Eristämiseksi DNA Mycobacterium tuberculosis kliinisistä näytteistä (aivo-selkäydinnesteestä, keuhkoputkien pesu), joka sisältää suuren määrän soluja, solujäänteitä, tai niiden suolat, riittävä sentrifugoida näytteen 3-4000. RPM, lisätä lietteen 20-30 ui 2%: ista triton X-100 ja lämmitettiin 90 ^noin C: ssa 30 minuutin ajan.

Valmistamiseksi yskösnäytettä on oltava tehokas nesteyttäminen, joka on yleensä käytetään 4%: sta natriumhydroksidia ja N-asetyyli-L-kysteiini (NALC) määränä 50-80 mg per näyte - riippuen näytteen viskositeetti. NALC-liuos on valmistettava ex tempore tai NALC-jauhe voidaan lisätä suoraan näytteen kuivaksi. Nesteytyksen jälkeen näytteet sentrifugoidaan 15 minuutin ajan 3,5 - 4000 kierrosta minuutissa (3000 g) 50 ml: n injektiopulloissa, joissa on kierrekorkit, esim. E. Samoissa olosuhteissa, joita suositellaan vatsan valmistukseen.

Louhinta DNA-pelletti menetelmä on käytetty useimmiten perustuu käytön 5-6 molaarista guanidiini-isotiosyanaattia hajotusreagenssi kuten mikrohuokoiset hiukkaset ja piioksidista ( "piimaa") sorboiva DNA-molekyyli. Epäspesifinen aineet, kuten inhibiittorit mahdollista, sitten pestiin 2,5 molaarista guanidiini ja etanoliliuosta, minkä jälkeen DNA-molekyyli on desorboidaan vedessä, ja nämä näytteet käytetään suorittamaan PCR. DNA-uuttamisen tekniikan yksinkertaistamiseksi "piimaa" korvataan usein piioksidilla päällystetyillä magneettisilla mikrohiukkasilla. Tällöin käytetään mikrotietojen erityistä magneettista jalustaa sentrifugoinnin sijasta hiukkasten saostamiseksi.

Venäjällä kehitettiin alkuperäinen menetelmä mykobakteerien immunomagneettiselle erottamiselle, jota seurasi patogeenin DNA: n uuttaminen. Mycobacterium tuberculosis immunomagneettisella erotusmenetelmällä käyttäen ferroparticles koko on 3-5 mikronia, päällystää piidioksidilla, johon on kiinnitetty kemiallinen sidos on polyklonaalinen (kaniinin) vasta-aineita Mycobacterium tuberculosis. Nokkosnäytteet emäksisen hajotuksen jälkeen neutraloidaan hapan tris-HCl-liuoksella ja inkuboidaan immunomagneettisen sorbentin kanssa. Sitten immunoferropartikkelit kerätään magneettisella sauvalla, jossa on vaihdettava kärki, siirretään mikrotubuun ja saostetaan. Lisätään 20-30 ui 2% Triton X-100 -liuosta ja kuumennetaan 30 minuuttia 90 ^° C: ssa. Supematanttia käytetään DNA-templaattina PCR-analyysiin.

Vaikea ongelma on mykobakteerin tuberkuloosi-DNA: n eristäminen biopsianäytteistä. Entsyymibiopsian osalta proteiini-entsyymiä K käytetään loppukonsentraatiossa 200-500 mg / l 56 ^° C ^{: n} lämpötilassa yön yli. Lisäksi käytetään yhtä tunnetuista menetelmistä. Ylimääräinen epäspesifinen DNA biopsian PCR-analyysissä aiheuttaa usein reaktion eston, joka vaatii toistuvasti DNA-uutetta.

Menetelmät tulosten havaitsemiseksi

Reaktion päättymisen jälkeen patogeenin monistetut DNA-fragmentit tunnistetaan erilaisilla menetelmillä.

Geelielektroforeesimenetelmä on hyvin tunnettu. Tuloksena oleva DNA-fragmentti tunnistetaan positiivisella kontrollilla, joka sisältää halutun spesifisen DNA-fragmentin, tai fragmentin tunnetun koon (nukleotidiparien lukumäärän), joka määritetään standardimolekyylimarkkerilla.

Spesifisen väriaineen läsnä ollessa etidiumbromidi sisältyy kaksoisjuosteiseen DNA: han. Synteettinen DNA-fragmentti havaitaan nauhan valoisena ultraviolettiliuoksen vaikutuksesta.

DNA-fragmentin koko, joka määritetään elektroforeesilla etäisyyden alusta, on vastattava tunnettua molekyylipainomarkkeria tai positiivista kontrollia.

Muut menetelmät määrittämiseksi PCR-tulokset perustuvat hybridisaation yhden ketjun PCR-tuotteet, joissa oligonukleotidin sille komplementaarinen - leimattua DNA-koetinta biotiinilla, minkä jälkeen havaitaan kautta entsymaattiset reaktiot, esimerkiksi sitomalla streptavidiini-biotiini alkalinen fosfataasi.

Tämäntyyppisen havainnoinnin perusteella on luotu PCR-analysaattorit, joissa PCR-tulosten havaitseminen suoritetaan automaattisesti tulosten optisen tiheyden lukemisen tuloksena näytteissä entsymaattisen reaktion ilmentymisen jälkeen.

Näiden menetelmien haitat ovat intralaboratorion kontaminaation mahdollisuudet melko lyhyillä DNA-molekyylien fragmentteilla. Kun molekyylit tulevat uusiin näytteisiin, niistä tulee PCR: n matriisi ja johtavat vääriin positiivisiin tuloksiin.

Tältä osin väärien positiivisten tulosten estämiseksi otetaan käyttöön tiloihin erottamisen ja eristämisen tiukat säännöt: DNA: n uuttaminen biologisista näytteistä; tiloja tulosten havaitsemiseksi (elektroforeesi) puhdasta vyöhykettä. Nämä tilat ovat todennäköisen saastumisen alue. Toinen eristetty alue on puhdas tila esitäytettävien DNA-näytteiden tuomiseksi putkiin PCR: n reaktioseoksella. Lopuksi oletetaan, että päälaite - DNA-vahvistin - sijoitetaan erilliseen, mahdollisesti toimistoon, huoneeseen.

Estää tuotteiden saastumisen edellisen reaktiot - noin Likon-amp PCR system testi sen sijaan dezoksinukleozidtimidina sisältävät dezoksinukleoziduridin joka, kun in vitro synteesi sisältyvän piirin sijasta oikeassa asennossa, ts Syntynyttä DNA: ta sisältävän tymiinin typpipitoinen emäs korvataan uracililla. Urasiili-DNA-glykosylaasi lisätään reaktioseokseen analyytille, tuhoaa vain kontaminoivia fragmentteja deoksiuridiinin, mutta ei DNA-natiivi analysoitu. . Seuraava lämmitys 94 ^° C ^: ssa inaktivoi tämän entsyymin eikä häiritse amplifikaatiota PCR: ssä.

RRNA: n isotermiseen monistukseen perustuva testijärjestelmä, jolle DNA-molekyylien käänteistranskriptio ja synteesi suoritetaan ensin. Joka vuorostaan on matriisi myöhemmälle RNA-molekyylien synteesille. RNA-amplikoneja detektoidaan akridiinilla värjätyllä DNA-koettimella hybridisoituna reaktioputkiliuokseen. Tämä menetelmä, jolla on suuri herkkyys, on etuna analysoitaessa yhdessä putkessa, mikä estää saastumisen. Tekijöiden mukaan tämän menetelmän herkkyys hengitysnäytteissä saavuttaa 90% spesifisyydestä 99-100%.

Uusia havaintomenetelmiä toteutetaan reaaliaikaisessa PCR: ssä. Nämä menetelmät poikkeavat ensisijaisesti kyseisessä PCR: ssä ja sen tulosten havaitseminen suoritetaan samanaikaisesti yhdessä suljetussa putkessa. Tämä ei ainoastaan teknisesti yksinkertaista analyysimenetelmää vaan estää myös laboratoriotilojen ja testinäytteiden saastumisen aikaisempien PCR-tuotteiden kanssa.

In reaaliaikainen PCR-havaitseminen tulokset johtuu fluoresenssiin aikana esiintyvä fluorogeenistä hybridisaatiokoettimena DNA amplifitsi Rui-PCR aikana spesifistä DNA-fragmenttia. Rakenne fluorogeeniset DNA-koettimet on rakennettu siten, että fluoresoiva markkeri vapautuu entsymaattisen reaktion tuloksena, tai etääntynyt sammuttaja molekyylin fluoresenssi ainoastaan spesifisen hybridisaation, joilla on haluttu DNA-molekyyli monistetaan PCR: n aikana. Kuten määrä koetinmolekyylien hybridisoitui fluoresenssin kasvu on verrannollinen havaitun tason molekyylien lukumäärän monistetun tuotteen. Koska jokaisella jaksolla lukumäärä PCR-fragmentin DNA-molekyylin kerrotaan puoli, jakson numero, josta fluoresenssi määritetään ja lisää kääntäen verrannollinen DNA-molekyylien alkuperäisessä näytteessä. Jos reaktio on esitellä kalibroijana useita eri tunnettuja pitoisuuksia molekyylien vastaava DNA-fragmentti, Mycobacterium tuberculosis, käyttäen tietokoneohjelmaa voidaan laskea ja määrää genomisen DNA: testimateriaalin.

Jokainen standardi näyte on päällekkäinen. Kvantitatiivinen kriteeri on PCR-syklien vähimmäismäärä, joka tarvitaan määritetyn fluoresenssin alkamiseen ja kasvuun. Abscissa - syklien lukumäärä; koordinaatti on fluoresenssiarvo. DNA-pitoisuudet ovat kääntäen verrannollisia fluoresenssin ilmenemiseen tarvittavien syklien lukumäärään. Oikeanpuoleisessa sarakkeessa (21-32) on merkitty syklinumerot vastaaville pitoisuuksille. Eroja DNA-fragmenttien kymmenkertaisten pitoisuuksien välillä 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 syklit. Kahdelle potilaalle IS6110-fragmenttien pitoisuudet olivat noin 10 ³ / ml ja 10 ⁴ / ml. Kun otetaan huomioon Mycobacterium tuberculosis -genomin genomissa analysoitujen fragmenttien toistojen (6 - 20) määrä, kliinisissä näytteissä mykobakteerien määrä on vastaavasti noin 100 ja 1000 solua.

PCR: n käyttö tuberkuloosin diagnoosissa

PCR-menetelmää käytetään eniten tuberkuloosin nopeutetussa diagnosoinnissa - mykobakteerin tuberkuloosin havaitseminen kliinisissä näytteissä: ysköksenä. Keuhkoputken huuhtelu, keuhkopussin tulehdus, virtsa, aivo-selkäydinneste, osteolyysi punctate, naisten sukuelinten suonien aspiratit ja erilaiset biopsianäytteet. Tutkimuksessa Alankomaissa noin 500 yskös ja keuhkoputkien huuhtelu näytteet 340 Diagnosoidun keuhkotuberkuloosi tutkittiin vertaamaan herkkyys PCR-menetelmiä, mikroskopia ja kulttuurin tutkimuksen tahroja. Analyysin herkkyys oli vastaavasti 92,6,88,9 ja 52,4%. Kaikkien menetelmien spesifisyys oli noin 99%.

Verrattiin mycobacterium tuberculosis -bakteerin detektoinnin tehokkuutta värimikroskopialla, kylvämällä Levenstein-Jensen-alustalla, VASTES-testijärjestelmällä ja PCR-analyysillä. PCR: n herkkyys oli 74,4%, mikroskopia - 33,8%, kylväminen tiheässä ympäristössä - 48,9% ja VASTES - 55,8%. Levenstein-Jensen-väliaineen keskimääräinen havaitsemisaika on 24 vuorokautta. VASTES - 13 päivää, PCR - 1 päivä.

Keskustellaan myös mahdollisuuksista käyttää PCR: tä herkäksi ja nopeaksi tuberkuloosihoidon tehokkuuden seurannaksi.

Havaitseminen Mycobacterium tuberculosis DNA: sta PCR tehokas kemoterapian pidemmän aikaa - keskimäärin 1,7 kuukausi verrattuna preparaatti määritelty fluoresenssimikroskoopilla, ja 2,5 kuukausi verrattuna bakteriologinen tutkimus.

Tuberkuloosin erikoislääkemuotojen diagnosointi

PCR: n merkitys herkkänä menetelmänä on erityisen suuri erikoispuhdistumaisille muodoille, koska näillä muodoilla kliiniset radiologiset menetelmät ja perinteiset bakteriologiset menetelmät tuberkuloosin mykobakteerien määrittämiseksi diagnostisissa materiaaleissa ovat tehottomia.

Tutkimuksessa virtsanäytteiden PCR-tulokset olivat positiivisia 16 17 potilailla, joilla on aktiivinen TB ja negatiivinen virtsan 4 potilasta aktiivinen munuaisten tuberkuloosi ja 39 potilasta, joilla on virtsateiden sairaus nontubercular.

PCR-analyysin tehokkuus tutkimalla luuytimen aspyraatteja potilailla, joilla oli tuntematonta kuumetta aiheuttanut kuume, osoitettiin epäillyn tuberkuloosin tapauksille. Tuberkuloottisen lymfadenitin diagnosoimiseksi tutkittiin 102 pistekyllästysainetta ja 67 lapsella, joilla epäillään tuberkuloosin lymfadeniittiä, biopsianäytettä lapsilla. Positiivisia tuloksia saatiin: 71,6% reaaliaikainen PCR. Fluoresenssimikroskopia - 46,3%. Kulttuurintutkimus - 41,8%. Tutkimuksessa 50 imusolmukkeen biopsiasta potilailla, joilla oli "cat scratch" tauti, kaikki tulokset olivat negatiivisia. Näin ollen PCR-analyysin 100-prosenttinen spesifisyys osoitettiin. Samassa työssä, imusolmukkeiden lävistysbiopsialla, todettiin M. Aviumin havaitsemismahdollisuus.

Naisten sukupuolielinten tuberkuloosin diagnosointi, kuten on tiedossa, on yksi vaikeimmista diagnoosiongelmista. Kun tutkittiin PCR: llä koepaloja kohdun limakalvon, kohdun limakalvon aspiraateissa nestenäytteitä Douglas tilaa 14 (56%) 25 potilasta tutkituista laparoscopically epäillään tuberkuloosia, saatiin positiiviset tulokset. Käyttämällä värjäysmikroskopiaa ja viljelmää saatiin vastaavasti 1 ja 2 tulosta. Nämä tapaukset olivat myös PCR-positiivisia. Useimmat PCR-positiiviset tulokset liittyivät tapauksiin, joissa oli tyypillisiä tuberkuloosin merkkejä histologisen tutkimuksen mukaan; pienempi määrä - epäilty tuberkuloosista laparoskooppitietojen mukaan. Vain yksi PCR-analyysin positiivinen tulos saatiin tuberkuloosin laparoskooppisten tietojen puuttuessa.

Kun tuberkuloosin eritysmuotoja diagnosoidaan, lääkäreillä on usein kysymys mahdollisuudesta havaita taudinaiheuttaja testatessaan verinäytteitä PCR-menetelmällä. Kirjallisista tiedoista käy ilmi, että DNA: n havaitseminen mycobacterium tuberculosista verinäytteistä on mahdollista kauaskantoisilla HIV-infektioiden muodoilla. Mycobacterium tuberculosis -bakteerin DNA havaittiin vain erilaisten elinten yleistyneen tuberkuloosin varalta potilailla, joilla oli siirretty munuainen ja immunosuppressio.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Mykobakteerien laji tunnistaa

PCR-menetelmä voi olla varsin tehokas tunnistaa nopeasti mykobakteereista tuberculosis ja jotkut mykobakteerilajeja nontubercular saatuaan alkuperäisen kasvun. Tässä tapauk- sessa PCR: n käyttö voi säästää 7-10 päivää, mikä on välttämätöntä positiivisen tuloksen myöhemmässä kulttuuritunnistuksessa. PCR-testi on teknisesti hyvin yksinkertainen, koska se ei vaadi kliinisen materiaalin monimutkaista näytteenvalmistusta korkean herkkyyden saavuttamiseksi. Tutkimuksessa 80 tässä testissä positiivisen järjestelmässä (MB Vasto. Organon yhtiö) kaikki positiiviset viljelmät PCR olivat tiukasti erityisiä ja pidettiin 1 päivä. Tunnistaa muita mykobakteerilajeja valmistettaessa DNA patogeenin kulttuurin hybridisoitiin erityisiä leimattujen DNA-koettimien kanssa akridiini ja kantojen havaita ulkonäön kemiluminesenssin välityksellä kemiluminometrissä tai nitroselluloosaliuskoille visuaalinen arviointi hybridisaation jälkeen. Tällaisen joukon avulla tunnistetaan rajoitettu määrä lajeja: mycobacterium tuberculosis complex. M. Avium, M. Avium -kompleksi, M. Kansasii ja M. Gordonae.

A.Telenti et ai. Kehitti myös suhteellisen yksinkertainen ja edullinen menetelmä lajien tunnistamiseksi kliinisesti tärkeä mykobakteerilajeja PCR: llä ja käsittelemällä sen jälkeen kaksi restriktioentsyymeillä (entsyymejä, joiden ominaisuudet leikata DNA-molekyylin tietyissä kohdissa). DNA-fragmentti monistetaan. Joka koodaa lämpösokkiproteiinin (65 kDa), ja käsitellään sitten saatua PCR-DNA-fragmentti 439 nukleotidiparia erikseen kaksi entsyymit - BstEII ja HaeIII. Analysoitiin sitten agaroosigeelielektroforeesilla saatiin kaksi tuotetta, määrittämällä niiden koko (emäsparien lukumäärää) käyttäen standardia DNA-fragmenttien sarja (molekyyli- DNA-markkereita) pituus 100-1000 emäsparia. Kussakin tietyntyyppisten (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) havaita kaksi tai kolme DNA-fragmenttia eri koko eri restriktioentsyymillä. Saatujen eri DNA-kokoelmien yhdistelmä mahdollistaa näiden lajien erilaistamisen keskenään.

Biologisten DNA-mikrosirujen tekniikkaa kehitetään. Joka auttaa tunnistamaan yli 100 lajia mykobakteereita yhdessä tutkimuksessa.

Lajintunnistuksessa voidaan suorittaa myös PCR-monistuksella 16S rRNA vaihtelevan alueen, jota seuraa amplikonin sekvensointia verrattuna vastaavan ensisijaisen rakenne, joka mahdollistaa tunnistamisen yli 40 mykobakteerilajeja.

PCR: n avulla voidaan suorittaa myös lajien tunnistus mycobacterium tuberculosis -kompleksissa, mukaan lukien M. Bovisin ja M. Bovis BCG: n erilaistuminen. Tätä varten analysoidaan tiettyjen geenien läsnäolo tai puuttuminen RD1: n genomisilla alueilla. RD9 ja RD10. RD1 puuttuu M. Bovis BCG: stä, mutta se esiintyy virulentteissä lajeissa, mukaan lukien M. Bovis.

Mycobacterium tuberculosis -bakteerin herkkyyden määrittäminen PCR: llä

Tavoitteet molekyyligenetiikan menetelmiä lääkeherkkyysmenetelmien tai resistenssiä Mycobacterium tuberculosis vähentää mutaatioiden tunnistamiseksi spesifisiä nukleotidisekvenssejä tunnettuja geenejä. Perusmenetelmiä perustuvat joko suoraan prochityvanii (sekvensointi) näiden sekvenssien monistusmenetelmän jälkeen tai hybridisaatio biotiinilla leimattua DNA-fragmentit monistetaan PCR: n aikana DNA-koettimia. Molemmissa vaihtoehdoissa havaittava nukleotidisubstituutiot sekvensseissä, että käyttämällä DNA-koettimia johtaa puuttumiseen tai epätäydellinen hybridisaatio nitroselluloosakalvolle käyttäen entsyymi-konjugaattia (streptavidiini-alkalinen fosfataasi) - Menetelmä LIPA-Rif-TB.

Menetelmä fluoresenssi mitataan paikallisesti kiinnitetty hieet DNA-koettimet ovat komplementaarisia tunnettuja mutaatioita PCR-monistetun geenin vastaavia alueita resistenssin tai lääkeaineen herkkyys, jota kutsutaan mikrobiochipov menetelmä. Tärkein algoritmi tämän tutkimuksen suorittamiseksi on seuraava. Eristämisen jälkeen DNA kliinisestä näytteestä tai kulttuuri mykobakteerien on tarpeen suorittaa PCR-monistus asiaankuuluvien fragmenttien rpoB-geenin vastaavan lääkeaineen herkkyys rifampisiini tai katG ja INHAN geenejä, jotka koodaavat proteiineja, Mycobacterium ovat vastuussa herkkyyttä Isoniatsidi. PCR-tulokset arvioidaan agaroosigeelielektroforeesilla, jossa halutun pituuden vastaavat DNA-fragmentit vahvistetaan. Sitten suoritetaan toinen kierros PCR: tä fluoresoivan leiman tuottamiseksi DNA: han. PCR: n tulokset vahvistetaan uudelleen geelielektroforeesilla. Sen jälkeen, hybridisaatio suoritettiin (inkuboitu yön yli), minkä jälkeen pestiin saatu materiaali on biosirun, joka on suuri määrä kiinteitä pieni lasilevy lyhyt DNA-säikeiden (koettimia), jotka ovat komplementaarisia nukleotidisekvenssejä lääkettä tunteva Mycobacterium tuberculosis pisteissä mahdollisista mutaatioista. Samoin kuin mutaatiosekvensseistä, jotka ovat vastuussa lääkeaineiden resistenssista. Sijainti DNA-koettimien levyllä - tarkasti määritelty, ja fluoresenssin taso, joka havaittiin hybridisaation määrittämiseksi tuloksen käyttämällä erityistä lukulaitetta on asennettu. Tässä suhteessa analyysin tulokset määritetään erityisellä tietokoneohjelmalla.

Viime vuosina on kehitetty vaihtoehtoisia menetelmiä mykobakteerien tuberkuloosin huumeiden herkkyyden määrittämiseksi reaaliaikaisen PCR-tekniikan perusteella, mikä mahdollistaa näiden tutkimusten suorittamisen suljetussa putkessa.

Kuviossa 4 on esitetty kuviossa 1 esitetyt. 13-13 esittää analyysituloksen kliinisiä isolaatteja Mycobacterium tuberculosis määritettäessä vastustuskyky rifampisiinin PCR reaaliajassa: 218 - kontrollinäyte (herkkä rifampisiini); 93 - positiivinen kontrolli Ser-Trp TCG-TGG: n mutaatiolle; 4482 - positiivinen kontrolli Ser-Leu TCG-TTG: n mutaatiolle; 162-322 - kokeelliset näytteet. 4-kanavien kineettisten käyrien laskemisen tulos: kanava 1: 393 - positiivinen kontrollti Ser-Trp TCG-TGG: n mutaatiolle; kanava 2: 4482 - positiivinen kontrolli Ser-Leu TCG-TTG: n mutaatiolle; 162, 163, 172, 295 - kokeelliset näytteet; kanava 4: kaikkien kokeeseen osallistuvien näytteiden monistamisen kineettiset käyrät. Monistusreaktion positiivinen kontrolli. Päätelmät: tulokset analyysi paljasti seuraavat mutaatiot, jotka määrittävät resistenssin rifampisiinin: näytteissä 162163172295 - Ser-Leu TCG-TTG. Samaa periaatetta käytettiin isoniazidin lääkeaineen vastustamiseksi katG: n ja inhA: n geeneihin, joka määrittää yleisimmät mutaatiot.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Mycobacterium tuberculosis -kantaa

Perusteellisimmin tutkittu tunnistusmenetelmä Mycobacterium tuberculosis on tekniikkaa kutsutaan restriktiofragmentin (RFLP RFLP,. Tai Englanti versio) ja joka perustuu fragmentirovanin (rajoitus) Mycobacterium tuberculosis DNA-entsyymin Pvu II ja saatujen fragmenttien myöhempi hybridisaatio tiettyjen sekvenssien DNA- sen toistuva elementti IS6110. Intraspesifinen vaihtelu toteutuu IS6110: n toistokertojen ja DNA: n sijainnin erilaisen määrän vuoksi. Sekä erilaisia etäisyydet tiettyjen kohtien hyökkäys restriktioentsyymiä (restriktiokohdat) ja elementin IS6110. Tämä tekniikka on hyvin monimutkainen ja aikaa vievä. Käsittelyn jälkeen DNA uutetaan Mycobacterium tuberculosis, geelielektroforeesi suoritetaan restriktioentsyymillä, ja siirrettiin sitten DNA-fragmentit eripituiset nitroselluloosakalvolle, hybridisaatio suoritettiin fragmenttien IS6110-elementin ja detektoidaan entsymaattisia reaktioita. Tuloksena saadut spesifisten DNA-kaistojen luonnehtii erityisesti Mycobacterium tuberculosis. Tietokoneanalyysin avulla tunnistetaan kantojen identiteetti tai suhde. Huolimatta siitä, että RFLP-menetelmä on kaikkein syrjivin, ts. Identifioi suurimman määrän eroja analysoidut kannat, se on tehoton pieni määrä (vähemmän kuin 5) IS6110-toistoja havaittu joissakin kannoissa. Kuviossa 4 on esitetty kuviossa 1 esitetyt. Kuviot 13-14 esittävät kantojen RFLP-typistämisen tuloksia.

Vaihtoehtona voi olla sukupolvenvaihdon menetelmä - analyyttinen välikappaleen DNA-sekvenssien polymorfismi - välituote DR-alueen suorien toistojen välillä. Kantojen spoligotypingin suorittamisen yhteydessä PCR suoritetaan alukkeilla, jotka rajoittuvat DR-alueelle, minkä jälkeen muodostetaan eri pituisia fragmentteja, jotka hybridisoituvat DNA: n vaihtelevien välisalueiden kanssa. Analysoidaan DR-alueen välike-sekvenssejä. Tutkijoiden mukaan, yksinkertaisempi, tuottavampi ja sopii kantojen primaariseen seulontaan ja alustavaan epidemiologiseen analyysiin sekä suoraan kliiniseen tutkimukseen.

Selvästi, tehokkaampi ja teknisesti käytettävissä oleva menetelmä on VNTR (lyhennys Englanti sanat), tai menetelmä, jolla määritetään muuttujan tandem-toistojen lukumäärän tarkka DNA Mycobacterium tuberculosis. Tämä menetelmä perustuu vain PCR: n käyttöön eikä se edellytä lisä manipulointia. Koska eri kantojen ja eri lokien tandem-toistojen lukumäärä on erilainen, eri kokojen fragmentit määritetään ja analysoidaan PCR-tuotteiden tuloksena olevasta elektroforeesista. Tutkijoiden mukaan VNTR: llä saavutetaan suurempi kantojen syrjintäaste kuin RFLP-menetelmällä.

Viime vuosina on kiinnitetty paljon huomiota W-Beijing-perheen Mycobacterium tuberculosis -kantojen jakeluun (joskus kutsutaan Pekingin kannaksi), jotka ovat suurelta osin huumeidenkestäviä.

Perusvaatimukset molekyylibiologisen tutkimuksen laadulle

[72], [73], [74], [75],

PCR: n perussäädökset

Tilaukset Venäjän terveysministeriö: №45 alkaen 02.07.2000 g .. Numero 109 21.03.2003 g .. Numero 64 alkaen 21.02.2000, suuntaviivat: 1.3.1888-04 "Työn organisointi tutkimuksissa käyttäen PCR materiaalia tartunnan taudinaiheuttajien biologinen patogeenisten ryhmien III-IV aineet "; 1.3.1794-03 "Työn organisointi PCR-materiaalin tutkimuksessa, joka on infektoitunut I-II-patogeenisuusryhmien mikro-organismeilla". 2003.; 3.5.5.1034-01 "puhdistaminen materiaalin, tartunnan bakteerit I-IV patogeenisyys ryhmät, kun PCR: ää käyttäen," 2001 liite 11 yhtenäinen ohjeet mikrobiologinen tutkimus menetelmien tunnistamiseen, diagnosointiin ja hoitoon tuberkuloosi.

[76], [77], [78]

Henkilökunta

Suoritus molekyylibiologian tutkimus voi järjestää lääkäreiden kliinisen laboratoriodiagnostiikan, lääkärit bacteriologists, virologien, lääkärit, biologit, kliininen taudinmäärityslaboratorion sekä asiantuntijoiden keskiasteen lääketieteellinen koulutus, kulunut erikoistuminen ja jatkokoulutus edellä kuvatulla tavalla.

Laboratoriotilat

Seuraavat laboratoriotilat ovat tarpeen:

• Näytteen käsittelyalue on laboratorio, joka on sovitettu toimimaan III-IV patogeenisyysryhmien infektiivisten aineiden kanssa menetelmän ohjeiden 13.1888-04 mukaisesti.
• Vyöhyke reaktioseosten valmistamiseksi PCR - laboratoriotila, joka suojaa sisäisestä laboratorion saastumiselta - "puhdas" alue.
• • Jos elektroforeesia tai hybridisaatiota käytetään PCR-tuotteiden analysointiin. Laboratorio huoneeseen, jossa kerrotut DNA-fragmentit erotetaan putket ja vahvistusta, vastaavasti, voi päästä ympäristöön, vaatimusten mukaisesti PCR-laboratorioissa (1.3.1794-03 suuntaviivat, ohjaus- 1.3.1888-04) on oltava täysin on eristetty edellisissä kappaleissa mainituista tiloista. Olisi jätettävä liikkumattomuuspistettä vyöhykkeelle elektroforeesi näytteiden käsittely ja "puhdas" alue tahansa henkilöstö, laitteet, kaikki materiaalit ja esineet sekä siirron ilmaa ilmanvaihtojärjestelmän tai seurauksena luonnoksia. Tätä vyöhykettä ei vaadita PCR-tuotteiden fluorimetrisen havaitsemisen kannalta.
• Tilat dokumentaatioon ja tulosten käsittelyyn on varustettu tietokoneilla ja tarvittavilla toimistolaitteilla. Tämä huone voi sisältää laitteita, jotka mahdollistavat PCR-tuotteiden havaitsemisen avaamatta putkea. - fluoresoivat PCR-ilmaisimet ja termiset syklitekijät reaaliaikaiselle PCR: lle.

Sanastus- ja epidemiologiset vaatimukset ysköksen ensisijaisessa hoidossa ovat samankaltaisia kuin mykobakteerien tuberkuloosin hoitoon liittyvät standardit mikrobiologiset vaatimukset.

[79], [80], [81], [82],

PCR-diagnostiikan laboratoriolaitteiden loppuun saattaminen

Laboratoriossa on laitteita seuraaviin tiloihin.

• näytteenvalmistusaika, sisältää seuraavat laitteet: II-luokan suojausluokka "SP-1.2": kiinteä tila -termostaatti, jossa on Eppendorf-tyyppisten testiputkien kuumakansi; mikrocentrifuga 13 000 rpm; sentrifugi (Vortex); jääkaappi, jossa on lämpötila-alueella -20 ^ja C-10 ^noin C; "Rroline" -sarjan vaihtelevan tilavuuden omaavat pipetit; pumppu, jossa on OM-1-pyydyspullo; jalusta pipeteille; jalustatyöasema 200x0,5 ml; kolmijalka työasema 50 x 1,5 ml; Testiputkien säilytyskannat 80x1,5 ml;
• Reaktioseoksen valmistuspaikka: suojakammio PCR-laatikko ("Laminar-C 110 cm"); sentrifugointi - Vortex; Proline-sarjan vaihtelevat tilavuuspipetit; jalusta pipeteille; kolmijalan työasema 200 x 0,2 ml; Testiputkien säilytyskannat 80x1,5 ml; jääkaappi, jossa on lämpötila-alueella -20 ^ja C + 10 ^ja C;
• huone elektroforeesille: kamera horisontaaliselle elektroforeesille; virtalähde; transilluminaattori;
• DNA-vahvistimet tai nukleiinihappoanalysaattori (PCR reaaliajassa) tietokoneella ja ohjelmistolla; voidaan sijoittaa mihin tahansa varahuoneeseen. Jos käytetään reaaliaikaista PCR-tekniikkaa. Tilaa elektroforeesille ei tarvita.

[83], [84], [85], [86]

Ulkoinen laadunvalvonta

Jotta voitaisiin luottaa objektiivisesti luotettavien tulosten saavuttamiseen, laboratorioiden olisi osallistuttava laboratoriotutkimuksen laatua koskevaan ulkoiseen arviointijärjestelmään.

Osallistujat laatujärjestelmään saavat; 12 ampullia kylmäkuivattua bakteerisolu suspensioita, joista kaksi sisältävät E. Coli E. Kookos, 3 injektiopulloa Mycobacterium tuberculosis (avirulentti) 10 ² / ml; 3 ampullia, joilla on samankaltaisen kannan solut pitoisuutena 10 ⁴ / ml; 2 ampullia, joiden ei-tuberkuloosi mykobakteerit M. Avium-intracellulare ja M. Kansasii konsentraatiossa 10 ⁵ / ml.

Hajautetut testit ulkoiselle laadun arvioinnille testataan kahdessa itsenäisessä laboratoriossa, joilla on laaja kokemus tällä alalla.

[87], [88]