Immunologiset tutkimukset urologiassa

Immunogrammin määrääminen urologiselle potilaalle tarkoittaa, että hoitava lääkäri epäilee immuunijärjestelmän häiriöiden esiintymistä. Toistuvat bakteeri-, virus- ja sieni-infektiot, allergiset oireet ja systeemiset sairaudet voivat olla merkkejä näistä häiriöistä, joille on ominaista useita oireyhtymiä (tarttuva, onkologinen, allerginen, autoimmuuni, lymfoproliferatiivinen). Yhdellä potilaalla voi olla useita oireyhtymiä. Esimerkiksi krooniset tartuntataudit (tarttuva oireyhtymä) voivat aiheuttaa immuunipuutoksen, ja immuunipuutos voi ilmetä alttiutena tartunta- ja onkologisille sairauksille (onkologinen oireyhtymä). Alttius infektioille voi ilmetä sekundaarisen immuunipuutoksen taustalla, joka on kehittynyt lymfoproliferatiivisen sairauden, kuten leukemian, seurauksena. Immuunijärjestelmässä on kolme pääryhmää patologisia muutoksia:

• immuunijärjestelmän yhden tai toisen linkin kvantitatiivinen tai toiminnallinen puutos, joka johtaa immuunikatotilan kehittymiseen;
• immuunijärjestelmän antigeenien tunnistamisen häiriö, joka johtaa autoimmuuniprosessien kehittymiseen;
• hyperreaktiivinen tai "perverssi" immuunivaste, joka ilmenee allergisten sairauksien kehittymisenä.

Immunodiagnostiikassa on seulontamenetelmiä (taso 1 -testit) ja selventäviä menetelmiä (taso 2 -testit). Ensimmäiset menetelmät on tarkoitettu immuunijärjestelmän häiriöiden kirjaamiseen, jälkimmäiset niiden toteuttamiseen liittyvien mekanismien selvittämiseen jatkoimmunokorrektiota varten.

B-solujen immuniteetti

Seulontamenetelmät

• B-lymfosyyttien suhteellisen ja absoluuttisen lukumäärän määritys immunofluoresenssilla tai virtaussytofluorometrialla käyttäen B-solujen antigeenejä vastaan suunnattuja monoklonaalisia vasta-aineita (CD19, CD20, jossa CD on erilaistumisklusterit). B-lymfosyyttien normaali pitoisuus aikuisilla on 8–19 % leukosyyttien kokonaismäärästä tai 190–380 solua/μl. B-lymfosyyttien määrän lisääntymistä esiintyy akuuteissa ja kroonisissa bakteeri- ja sieni-infektioissa, kroonisissa maksasairauksissa, systeemisissä sidekudossairauksissa, kroonisessa lymfosyyttisessä leukemiassa ja myeloomassa.
• Epäspesifisten immunoglobuliinien (F, M, G, E) pitoisuuden määritys yksinkertaisella radiaalisella immunodiffuusiolla, nefelometrialla tai turbometrialla, radioimmunomäärityksellä tai entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA). Aikuisten normit: immunoglobuliini (Ig) A 0,9-4,5 g/l. IgM 03-3,7 g/l. IgG 8,0-17 g/l. Immunoglobuliinien pitoisuuden nousua esiintyy samoissa patologisissa tiloissa, joissa B-lymfosyyttien pitoisuus kasvaa. Immunoglobuliinien pitoisuuden laskua esiintyy synnynnäisessä hypogammaglobulinemiassa, immuunijärjestelmän kasvaimissa, pernan poistossa, proteiinin menetyksessä, munuais- tai suolistosairauksissa, sytostaattien ja immunosuppressanttien hoidossa.

Selkeyttäviä menetelmiä

• Veressä kiertävien immuunikompleksien määritys selektiivisellä saostamisella polyetyleeniglykolissa, jota seuraa spektrofotometrinen tiheysmittaus (normaali 80-20 U). Verenkierrossa kiertävien immuunikompleksien lisääntyminen on tyypillistä akuuteille bakteeri-, sieni- ja virusinfektioille, autoimmuunisairauksille, immuunikompleksisairauksille, seerumitaudille ja tyypin 3 allergisille reaktioille.
• Spesifisten immunoglobuliinien määritys verestä bakteeri- ja virusantigeenien suhteen, deoksiribonukleiinihappo (DNA) autoimmuunisairauksissa, siittiöiden vasta-aineiden (autoimmuuni hedelmättömyys) ja munuaisvasta-aineiden (pyelonefriitti ja glomerulonefriitti) havaitseminen radiaalisella immunodiffuusio- tai ELISA-menetelmällä.
• Siittiösolujen vasta-aineiden määritys siittiöistä [MAR-testi (mixed antiglobulin reaction)], normaali - negatiivinen tulos.
• Immunoglobuliinien pitoisuuden määrittäminen virtsassa pyelonefriitin ja glomerulonefriitin välistä erotusdiagnoosia varten (proteinurian selektiivisyys).
• IgE-pitoisuuden määrittäminen eturauhasen nesteessä allergisen prostatiitin diagnosoimiseksi käyttäen radiaalista immunodiffuusiomenetelmää tai ELISA:a.
• B-lymfosyyttien blastitransformaation reaktion vasteen tutkimus B-solujen mitogeenille (kermesmarjan mitogeeni B-lymfosyyttien blastitransformaation reaktion stimuloimiseksi T-lymfosyyttien läsnä ollessa), jonka normatiivinen arvo on 95-100%.

T-solujen yhteys immuniteettiin

Seulontamenetelmät

• Kypsien CD3-T-lymfosyyttien suhteellisen ja absoluuttisen lukumäärän määritys immunofluoresenssireaktiolla tai virtaussytofluorometrialla käyttäen monoklonaalisia anti-CD3-vasta-aineita. Aikuisilla normaaliarvo on 58–76 % tai 1100–1700 solua/μl. T-lymfosyyttien määrän väheneminen on merkki soluvälitteisen immuniteetin vajaatoiminnasta. Tämä on tyypillistä joillekin sekundaarisille ja primaarisille immuunipuutoksille (krooniset bakteeri- ja virusinfektiot: tuberkuloosi, hankittu immuunipuutosoireyhtymä, pahanlaatuiset kasvaimet, krooninen munuaisten vajaatoiminta, vammat, stressi, ikääntyminen, aliravitsemus, sytostaattihoito, altistuminen ionisoivalle säteilylle). T-lymfosyyttien määrän lisääntyminen tapahtuu immuunihyperaktiviteetin taustalla tai lymfoproliferatiivisissa sairauksissa. Tulehduksessa T-lymfosyyttien määrä ensin kasvaa ja sitten laskee. T-lymfosyyttien vähenemisen puuttuminen viittaa krooniseen tulehdusprosessiin.
• Lymfosyyttien alaryhmien arviointi.
  • T-auttajasolujen (anti-CD4-vasta-aineiden) määrän määritys. Normaalisti 36–55 % tai 400–1100 solua/mcl. Näiden solujen määrä lisääntyy autoimmuunisairauksissa, Waldenströmin taudissa ja elinsiirtoimmuniteetin aktivoitumisessa; T-auttajasolujen määrä vähenee kroonisissa bakteeri-, virus- ja alkueläininfektioissa, tuberkuloosissa, hankitussa immuunipuutosoireyhtymässä, pahanlaatuisissa kasvaimissa, palovammoissa, vammoissa, aliravitsemuksessa, ikääntymisessä, sytostaattihoidossa ja altistuksessa ionisoivalle säteilylle.
  • T-suppressorien (anti-CD4-vasta-aineiden) määrän määritys. Normaalisti 17–37 % tai 300–700 solua/μl. T-suppressorien määrä kasvaa samoissa olosuhteissa, joissa T-auttajasolujen määrä vähenee, ja niiden väheneminen tapahtuu samoissa olosuhteissa, joissa T-auttajasolujen pitoisuus kasvaa.
  • Immunosäätelyindeksi CD4/CD8, normaalisti 1,5–2,5. Yliaktiivisuus arvoilla yli 2,5 (allergiset ja autoimmuunisairaudet); hypoaktiivisuus alle 1,0 (alttius kroonisille infektioille). Tulehdusprosessin alussa immunosäätelyindeksi nousee ja normalisoituu sen laskettua.

Selkeyttäviä menetelmiä

• Luonnollisten tappajasolujen (NK-solujen) määrän määritys - anti-CD16- ja anti-CD56-vasta-aineet. CD16-lymfosyyttien normaaliarvo on 6-26%, CD56-solujen 9-19%. NK-solujen määrä kasvaa elinsiirron hyljinnän aikana, vähenee virusinfektioiden, syövän, primaarisen ja sekundaarisen immuunipuutoksen, palovammojen, vammojen ja stressin, sytostaattihoidon ja ionisoivan säteilyn altistumisen yhteydessä.
• Interleukiini-2-reseptorin (aktivaatiomarkkeri) omaavien T-lymfosyyttien lukumäärän määritys - anti-CD25-vasta-aineet. Normaali on 10-15%. Niiden lukumäärän kasvua havaitaan allergisissa sairauksissa, elinsiirron hyljintäreaktiossa, vasteessa kateenkorvasta riippuville antigeeneille primaarisen infektion akuutissa vaiheessa, ja vähenemistä samoissa sairauksissa, joissa NK-solujen määrä vähenee.
• Aktivaatiomarkkerin - luokan II histosysäytyvyysmolekyylin HLA-DR:n - ilmentymisen tutkimus. Lisääntynyt ilmentyminen tapahtuu tulehdusprosesseissa, hepatiitti C:tä, keliakiaa, kuppaa ja akuutteja hengitystiesairauksia sairastavilla potilailla.
• Lymfosyyttien apoptoosin arviointi. Karkea käsitys lymfosyyttien valmiudesta apoptoosiin voidaan saada Fas-reseptorin (CD95) ilmentymisestä niiden pinnalla ja bd-2-proto-onkogeenin ilmentymisestä mitokondrioissa. Lymfosyyttien apoptoosia arvioidaan käsittelemällä niitä kahdella fluoresoivalla väriaineella: propidiumjodidilla, joka sitoutuu DNA-fragmentteihin, ja anneksiini Y:llä, joka sitoutuu fosfatidyyliseriiniin, joka ilmestyy solukalvolle apoptoosin alkaessa. Tulokset arvioidaan virtaussytometrillä. Tulokset lasketaan eri väriaineilla värjäytyneiden solujen suhteen perusteella. Värjäämättömät solut ovat elinkelpoisia, vain anneksiini Y:hen sitoutuneet solut ovat apoptoosin varhaisia ilmentymiä, propidiumjodidilla ja anneksiini Y:llä värjäytyvät solut ovat apoptoosin myöhäisiä ilmentymiä, ja värjäytyminen pelkästään propidiumjodidilla osoittaa nekroosia.
• T-lymfosyyttien proliferaation arviointi in vitro.
  • Muutokset solublastogeneesissä - lymfosyyttien blastitransformaatioreaktio. Leukosyyttejä inkuboidaan minkä tahansa kasviperäisen mitogeenin (lektiinien) kanssa. Fytohemagglutiniinia käytetään useimmiten 72 tunnin ajan, minkä jälkeen otetaan sivelynäyte, joka värjätään ja blastien lukumäärä lasketaan! Stimulaatioindeksi on transformoituneiden solujen prosenttiosuuden suhde kokeessa (viljelmä fytohemagglutiniinilla) transformoituneiden solujen prosenttiosuuteen kontrollissa (viljelmä ilman fytohemagglutiniinia). Lymfosyyttien blastitransformaatioreaktiota voidaan arvioida lisäämällä viljeltyihin soluihin radioaktiivista leimaa (ZN-thymdinum), koska DNA-synteesi lisääntyy solujen jakautumisen aikana. Proliferatiivisen vasteen häiriöitä esiintyy sekä primaarisissa että sekundaarisissa immuunipuutoksissa, jotka liittyvät infektioihin, syöpään, munuaisten vajaatoimintaan ja kirurgisiin toimenpiteisiin.
  • Näissä tutkimuksissa arvioidaan aktivaatiomerkkiaineiden (CD25, transferriinireseptori - CD71) ja luokan II HLA-DR:n (MHC) ilmentymistä, joita ei käytännössä esiinny lepotilassa olevissa T-lymfosyyteissä. T-lymfosyyttejä stimuloidaan fytohemagglutiniinilla, ja kolmen päivän kuluttua aktivaatiomerkkiaineiden ilmentymistä analysoidaan suoralla tai epäsuoralla immunofluoresenssireaktiolla, virtaussytofluorometrialla, käyttäen eristettyjen reseptorien monoklonaalisia vasta-aineita.
  • Aktivoituneiden T-lymfosyyttien syntetisoimien välittäjäaineiden [interleukiini (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferoni jne.] määrän mittaus radioimmunomäärityksellä tai ELISA:lla. Erityisen tärkeää on arvioida γ-interferonin ja IL-4:n pitoisuuksia Th1- ja Th2-markkereina aktivoitujen viljelmien supernatantissa ja solun sisällä. Jos mahdollista, on hyödyllistä määrittää vastaavan sytokiinin geenien ilmentyminen tuottajasolun matriisiribonukleiinihapon tason ja vastaavien sytokiinien reseptorien ilmentymisen voimakkuuden perusteella.
    
• Lymfosyyttien migraation estoreaktio. Herkistetyt T-lymfosyytit erittävät reaktiossa antigeenin kanssa lymfokiineja, mukaan lukien lymfosyyttien migraatiota estäviä tekijöitä. Estoilmiö havaitaan, kun mitogeenejä lisätään soluviljelmään. Estoasteen arviointi antaa meille mahdollisuuden arvioida lymfosyyttien kykyä erittää sytokiineja. Normaalisti migraatiotaajuus on 20–80 % riippuen spesifisestä mitogeenistä.
• NK-solujen sytotoksisuuden arviointi. Määritetään luonnollisten tappajasolujen kyky tappaa K-562-erytromyeloidisolulinjan kohdesoluja. Jos arvioidaan vasta-aineriippuvaista sytotoksisuutta, käytetään IgG-vasta-aineilla päällystettyjä kohdesoluja. Kohdesolut leimataan 3H-uridiinilla ja inkuboidaan efektorisolujen kanssa. Kohdesolujen kuolema arvioidaan vapauttamalla radioaktiivinen merkki liuokseen. Sytotoksisuuden vähenemistä havaitaan pahanlaatuisissa kasvaimissa. Joissakin tapauksissa, kun on tarpeen ennustaa interleukiinihoidon tehokkuutta, NK-solujen sytotoksisuutta arvioidaan tiettyjen sytokiinien kanssa inkuboinnin aikana.

Fagosyyttien toiminnan tutkimus

Seulontamenetelmät

Mikrobisolujen fagosyyttien imeytymisen intensiteetin tutkimus (lateksihiukkasten fagosytoosi, stafylokokin, E. colin tai potilaasta eristettyjen mikro-organismien testiviljelmä). Heparinoitua verta sentrifugoimalla eristetään leukosyyttisuspensio, johon lisätään IV-veriryhmän seerumia opsonisaatiota varten (opsoniinit ovat proteiineja, jotka tehostavat fagosytoosia). Mikrobisuspensio laimennetaan, sekoitetaan leukosyyttien kanssa ja inkuboidaan 120 minuuttia, ja näytteet otetaan analyysiä varten 30, 90, 120 minuuttia inkubaation alkamisen jälkeen. Kerätystä leukosyyttisuspensiosta tehdään sivelynäytteet. Seuraavat fagosytoosi-indikaattorit määritetään:

• fagosyyttinen indeksi - niiden solujen prosenttiosuus, jotka siirtyivät fagosytoosiin 30 minuutin ja 120 minuutin kuluessa inkubaatiosta; fagosyyttisen indeksin (30) standardiarvo on 94 %, fagosyyttisen indeksin (120) 92 %;
• fagosyyttinen lukumäärä - solunsisäisesti sijaitsevien bakteerien keskimääräinen lukumäärä; fagosyyttisen lukumäärän (30) vakioarvo on 11%, fagosyyttisen lukumäärän (120) 9,8%;
• fagosyyttien lukumäärän kerroin - fagosyyttien lukumäärän (30) suhde fagosyyttien lukumäärään (120); normaalisti 1,16;
• Neutrofiilien bakterisidinen indeksi - fagosyyttien sisällä kuolleiden mikrobien lukumäärän suhde imeytyneiden mikrobien kokonaismäärään; normaalisti 66 %.

Selkeyttäviä menetelmiä

• Fagosyyttien bakterisidisen kyvyn tutkimus nitrosinisen tetratsolium-testissä (NBT) - NBT-testi. Leukosyytteihin lisätään keltaista nitrosinisen tetratsolium-väriainetta. Kun neutrofiili absorboi väriaineen, vapaiden happiradikaalien vaikutuksesta tapahtuu pelkistymisprosessi, joka johtaa siniseen väriin. Reaktio suoritetaan 96-kuoppaisessa tasapohjaisessa levyssä. Kolmeen ensimmäiseen kuoppaan lisätään Hanksin liuosta (spontaani NBT) NBT:n ja leukosyyttien seoksen kanssa, ja toiseen kuoppaan lisätään lateksihiukkasia; seosta inkuboidaan 37 °C:ssa 25 minuuttia. Tulokset luetaan 540 nm:ssä lukijalla ja ilmaistaan mielivaltaisina yksiköinä. Stimulaatiokerroin (K _st ) lasketaan stimuloitujen kuoppien optisen tiheyden suhteena stimuloimattomien kuoppien keskimääräiseen optiseen tiheyteen. Terveillä ihmisillä NBT _spont = 90 ± 45 CU, NBT _stim = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Adheesiomolekyylitutkimus. Virtaussytofluorimetriaa käytetään pinta-antigeenien CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18 ilmentymisen määrittämiseen. Immuunipuutokset, joihin liittyy heikentynyt adheesio, ilmenevät toistuvina infektioina, hitaana haavan paranemisena ja märän puuttumisena infektiopesäkkeistä.

Komplementtijärjestelmän tutkimus

Seulontamenetelmät

Komplementin hemolyyttisen aktiivisuuden määritys on tutkimus komplementin aktivaation klassisesta reitistä. Sairaan ja terveen henkilön seerumin eri laimennoksia lisätään vasta-aineilla päällystettyihin punasoluihin. Hemolyyttisen aktiivisuuden yksikkö on seerumin laimennoksen käänteisluku, jossa 50 % punasoluista tuhoutuu. Hemolyysin aste arvioidaan fotometrisesti hemoglobiinin vapautumisen perusteella liuokseen. Komplementin hemolyyttisen aktiivisuuden vähenemistä havaitaan munuaisvaurioon liittyvässä systeemisessä lupus erythematosuksessa, akuutissa glomerulonefriitissä, yhdistelmäimmuunipuutoksissa, myastheniassa, virushepatiitissa, lymfoomissa ja lisääntymistä obstruktiivisessa keltataudin, Hashimoton tyreoidiitti, reuma, nivelreuma, nodulaarinen periarteriitti, dermatomyosiitti, sydäninfarkti, haavainen paksusuolitulehdus, Reiterin oireyhtymä ja kihti.

Selkeyttäviä menetelmiä

• Komplementtikomponenttien määritys. Kvantitatiivinen määritys suoritetaan radiaalisella immunodiffuusiolla ja nefelometrialla.
  Tutkimus ei ole informatiivinen, ellei komplementtikomponenttien antigeenisiä ominaisuuksia muuteta.
• On todettu, että komplementin Clq-komponentti tehostaa fagosytoosia ja välittää solusytotoksisuutta. Sen vähenemistä esiintyy immuunikompleksisairauksissa, systeemisessä lupus erythematosuksessa, märkäisissä infektioissa ja kasvaimissa.
• C3-komponentti osallistuu klassisen ja vaihtoehtoisen komplementtireitin aktivoitumiseen. Sen pitoisuuden lasku liittyy kroonisiin bakteeri- ja sieni-infektioihin sekä verenkierrossa tai kudoksessa olevien immuunikompleksien esiintymiseen.
• C4-komponentti osallistuu klassisen signatuurireitin aktivoitumiseen. Sen pitoisuuden lasku liittyy immuunikompleksien pitkittyneeseen komplementin aktivaatioon ja C1-estäjän pitoisuuden laskuun, joka kontrolloi klassisen komplementtireitin aktivaatiota. C4-puutosta esiintyy systeemisessä lupus erythematosuksessa, C4-pitoisuuden nousua esiintyy munuaissairaudessa, elinsiirron hyljintäreaktiossa, akuutissa tulehduksessa ja ruoansulatuskanavan sairauksissa.
• C5a on pieni osa C5-molekyylistä, joka irtoaa siitä komplementtijärjestelmän aktivoitumisen seurauksena. Sen pitoisuus kasvaa tulehduksen, sepsiksen, atooppisten ja allergisten sairauksien aikana.
• Cl-inhibiittori on monitoiminen tekijä. Se säätelee komplementtikomponentin C1 aktivaatiota, estää kallikreiinin, plasmiinin ja aktivoituneen Hageman-tekijän, Cls- ja Or-proteaasien aktiivisuutta. C1-inhibiittorin puutos johtaa angioödeemaan.
• Komplementin toiminnalliset tutkimukset. Testiseerumi lisätään standardiseerumiin, josta puuttuu komplementtikomponentti, ja komplementin hemolyyttinen aktiivisuus määritetään. Jos hemolyyttinen aktiivisuus ei palaudu normaaliksi, tämän komplementtikomponentin aktiivisuuden testiseerumissa katsotaan vähentyneen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]