Alkion kantasolut

Alkion kantasolujen löytäminen ei syntynyt sattumalta, vaan ne syntyivät kehitysbiologian tieteellisen tutkimuksen pohjalta. Termi "kantasolu" otettiin lääketieteeseen käyttöön vuonna 1908 Berliinin hematologisen seuran kongressissa Alexander Maximovin toimesta hematopoieettisten solujen yhteydessä. Kauan ennen pluripotenttien alkion kantasolujen stabiilien linjojen eristämistä ja tuotantoa terato-(alkiokarsinooma)kantasoluja käytettiin varhaisten kehitysprosessien tutkimuksissa, joiden avulla tutkittiin tuntemattomia alkionkehityksen mekanismeja, mukaan lukien varhaisten geenien ilmentymissekvenssiä ja niiden aktiivisuuden proteiinituotteita.

Mutta menetetäänkö ihmisen genomin totipotenssi peruuttamattomasti evoluutioprosessissa? Ei, ja alkionkehitys on todiste tästä. Jos näin on, niin milloin periaatteessa toteutuu evoluution toinen polku? Todennäköisesti silloin, kun ihminen saapuu avaruuteen, jossa ympäristöolosuhteet pysyvät suhteellisen vakioina riittävän pitkään. Luukudosten menetystä (luiden demineralisaatio painottomuuden tilassa), joka on hyvin hitaasti uudelleenmuokautuva ja uudistuva, voidaan pitää ensimmäisenä askeleena ihmisen sopeutumisprosessissa lajina avaruusolosuhteisiin. Evoluution toisen polun hinta on kuitenkin erilainen - kaikkien solujen totipotenssin ja absoluuttisen plastisuuden palauttamisen hinta on steriiliys. Joten tässä "evoluutiokameleonttien" maailmassa meidän on lisääntyttävä ilman meioosia, silmukoimalla. Mutta elämme pitkään. Telomeraasin kuolemattomuus on ameeban kuolemattomuus. Monisoluisessa organismissa kantasolut ovat määrällisen ja laadullisen pitkäikäisyyden substraatti.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Alkion kantasolujen lähteet

Nykyään laboratoriotutkimukseen käytettävien alkion kantasolujen lähteinä käytetään hiiren teratokarsinoomasolulinjoja (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) ja ihmisen teratokarsinoomasolulinjoja (NTERA-2, TERA-2, H-9-klooni) sekä Trauneonin alkion kantasolulinjoja. Yksityiskohtaisen solupassin saatavuus, joka osoittaa immuunifenotyypin, kromosomianalyysin tulokset, mRNA:n ilmentymisprofiilit, näkyvät reseptorit ja solunsisäiset signalointiproteiinit, ei kuitenkaan kompensoi teratokarsinooma-alkiokantasolujen merkittäviä puutteita – nopeaa totipotenssin menetystä ja mahdottomuutta käyttää niitä kliinisissä tutkimuksissa, kun taas sekamuotoinen erilaistuminen viljelmässä tekee puhtaasti erikoistuneen solulinjan eristämisen heterogeenisestä solupopulaatiosta erittäin vaikeaksi. Siksi kliinisiin tarkoituksiin luotujen alkion kantasolujen lähteenä on yleensä blastokystan sisäinen solumassa, 8-soluvaiheen alkioiden yksittäiset blastomeerit, myöhempien vaiheiden morulasolut sekä alkukantasolut.

On huomattava, että teratokarsinoomasoluilla, vaikka niillä on pluripotenssi, on huomattavasti alhaisempi pluripotentti potentiaali verrattuna alkion kantasoluihin. Niiden integroituminen alkiosoluihin johtaa harvoin kimeerien muodostumiseen, jotka eivät myöskään koskaan muodosta teratokarsinoomasolujen genotyyppisiä sukusoluja. Tämän uskotaan johtuvan kromosomipoikkeavuuksien yleisestä esiintymisestä teratokarsinoomasolujen viljelyn aikana: Y-kromosomin menetyksestä, erilaisista trisomioista, deleetioista tai translokaatioista.

Ihmisen alkion kantasolulinjan eristämistä on yritetty toistuvasti, mutta tätä tehtävää ei ole ratkaistu, koska normaaleja ihmisen blastokystoja on vaikea saada. Lisäksi kromosomipoikkeavuuksien esiintyvyys ihmisillä on suurempi kuin eläinten alkiogeneesissä. Suurin osa varhaisista koeputkihedelmöityksen jälkeen saaduista ihmisalkioista on kaoottista kromosomimosaiikkia ja niillä on usein numeerisia ja rakenteellisia poikkeavuuksia. Vielä myöhemmin, blastokystin vaiheessa, vain 20–25 % ihmisalkioista koostuu soluista, joilla on normaali karyotyyppi. Tällaisten alkioiden käyttö alkion kantasolujen luomiseen oli käytännössä mahdotonta, koska tsygootit viljeltiin yleensä kahden tai neljän blastomeerin vaiheeseen ja siirrettiin sitten kohtuun. Vasta suhteellisen äskettäin on kehitetty luotettava tekniikka hedelmöitettyjen ihmisen munasolujen viljelyyn blastokystin vaiheeseen asti. Tämän tekniikan käyttöönotto koeputkihedelmöityksen käytännössä ei ole ainoastaan lisännyt onnistuneiden implantaatiotulosten esiintyvyyttä, vaan myös tehnyt normaaleista blastokystoista helpommin saatavilla olevan kohteen.

Toinen pluripotenttien kantasolujen lähde ovat primaarisukusolut, joilla, toisin kuin germinaaliepiteelin kehittyneemmillä progenitoripopulaatioilla, ei ole pinnallaan beeta-integriiniä, mutta ne ilmentävät voimakasta alkalisen fosfataasin aktiivisuutta. On huomattava, että primaarisukusoluista muodostuneiden kantasolujen populaatioita on tutkittu kokeellisesti 1980-luvulta lähtien. Tuolloin kehitettiin tekniikka primaarisukusolujen eristämiseksi hiiren alkion sukurauhasen alkeista. Ensimmäiset epäonnistuneet tulokset primaarisukusolujen viljelystä in vitro viittasivat näiden yritysten turhuuteen, koska solut, vaikka ne selvisivätkin, eivät lisääntyneet ja kuolivat ensimmäisen päivän aikana. Myöhemmin todettiin, että hiiren primaarisukusolut lisääntyvät in vitro vain liukoisten ja kalvoon sitoutuneiden spesifisten polypeptidikasvutekijöiden läsnä ollessa viljelyalustassa. Lukuisien tutkimusten tulokset ovat osoittaneet, että primaarisukusolujen selviytymiselle ja lisääntymiselle viljelyalustassa tarvitaan paitsi LIF-tekijöitä myös kalvoon sitoutuneita ja liukoisia Steel-tekijöitä (SIF). Näitä peptidejä tuottavat Steel-mutaation suhteen homotsygoottisten alkioiden somaattiset solut, ja yksi niistä on cKit-proto-onkogeenin ligandi.

Nisäkkäiden ja ihmisten primaarisilla sukusoluilla on ekstragonadaalinen alkuperä ja ne ovat sukusolulinjan klonaalisen kehityksen lähde. Primaarisen sukusolulinjan, samoin kuin kaikkien alkion kudosten ja ekstraembryonisen mesodermin, alkuperä on varhaisten alkioiden epiblasti (primaarinen ektodermi), jolla on mosaiikkinen rakenteellinen organisaatio. Käyttämällä varhaisen alkion eri osien mikrokirurgista poistomenetelmää, primaaristen sukusolujen esiasteiden kloonin lokalisaatiovyöhyke epiblastissa määritettiin. Käyttämällä rodamiinidekstraania, jota käytettiin solumarkkerina, määritettiin, että primaaristen sukusolujen esiasteet sijaitsevat epiblastin proksimaalisella alueella, lähellä ekstraembryonista ektodermia. Primaarinen sukusolulinja syntyy 45-soluisesta kloonista, jonka jakautuminen tapahtuu aivan gastrulaation alussa. Sitten klooni eriytyy, ja gastrulaation aikana primaariset sukusolut siirtyvät ekstraembryoniseen mesodermiin ja sijaitsevat allantois-rudimentin pohjalla primaarisen juovan takana. Sieltä primaariset sukusolut siirtyvät kohti takasuolen endodermin vatsapuolta ja liikkuvat sitten aktiivisesti suolilievettä pitkin, täyttäen sukupuolielinten harjanteet migraation lopussa. Migraation aikana sekä sukupuolirauhasten rudimentissa lokalisoitumisen ensimmäisten 2–3 päivän aikana primaariset sukusolut lisääntyvät aktiivisesti ja käyvät läpi kahdeksan replikaatiosykliä. Jos migraation alussa on noin 50 primaarista sukusolua, niin 12 päivän kehitysvaiheessa olevien hiirialkioiden sukupuolielinten harjanteissa primaaristen sukusolujen määrä ylittää 25 000.

ESC-solujen ja primaarisukusolujen toiminnallinen samankaltaisuus ilmenee jälkimmäisten täydellisenä integroitumisena blastokystaan sisäisen solumassan korvautuessa ja sitä seuraavana alkion täysimittaisena kehityksenä, jonka kudokset koostuvat vain primaarisukusolujen jälkeläisistä. Muilta ominaisuuksiltaan hiiren primaarisukusolut osoittautuivat myös identtisiksi ESC-solujen kanssa, mikä osoitti kyvyn erilaistua useisiin suuntiin, muodostaa alkionkappaleita in vitro ja muodostaa teratomeja in vivo, kun niitä annetaan ihon alle immuunipuutteisille hiirille, muistuttaen spontaania kivesten teratoomia 129/ter-hiirillä.

Havaittiin, että kun kasvatusalustaan lisätään LIF:ää, kalvoon sitoutunutta ja liukoista SIF:ää, 8 päivän ikäisten hiirialkioiden eristetyt primaariset sukusolut selviävät ja lisääntyvät viljelmässä 4 päivää, mutta kuolevat sitten. Lisäksi ajanjakso, jolloin primaaristen sukusolujen kuolema havaitaan viljelmässä, osuu yksiin hiirialkioiden kehitysvaiheen kanssa (12,5–13,5 päivää), jolloin naaraspuoliset primaariset sukusolut siirtyvät meioosiin sukurauhasten alkeissa ja urospuolisten primaaristen sukusolujen mitoottiset jakautumiset estyvät. Jos kasvatusalustaan lisätään kuitenkin paitsi kasvutekijöitä LIF ja SIF myös FGF2, primaariset sukusolut jatkavat lisääntymistään ja aliviljelmissä muodostuu solupesäkkeitä, jotka kykenevät lisääntymään jopa kasvutekijöiden (SIF ja FGF) poistamisen jälkeen kasvatusalustasta. Tällaisia soluja voidaan viljellä pitkään alkion fibroblastien substraatilla lisäämättä liukoista kasvutekijää LIF. Ehdotettiin, että näitä primaarisista sukusoluista saatuja stabiileja solulinjoja kutsuttaisiin alkion sukusoluiksi. Tämä termi ei ole lainkaan onnistunut, koska EG-soluja viljelemällä on mahdotonta saada alkion sukusoluja, jotka kykenevät suorittamaan seuraavia oogeneesin tai spermatogeneesin vaiheita. Tämä johtuu siitä, että EG-solulinjat, vaikka ne ovatkin peräisin alkukantaisista sukusoluista, menettävät viljelmässä alkion pluripotenttien kantasolujen ominaisuudet ja ne menettävät kyvyn sitoutua sukulinjoihin. Toisin sanoen alkukantasolut menettävät viljeltyinä sukusolujen esiasteiden ominaisuudet ja muuttuvat alkion kantasolujen kaltaisiksi pluripotenteiksi soluiksi.

On havaittu, että teratoomia ei synny, kun EG-soluja viedään immuunipuutteisiin hiiriin. Oletetaan, että ihmisen EG-solujen kyvyn menetys tuottaa teratoomia johtuu siitä, että näitä solulinjoja ei luotu suoraan viljellyistä primaarisista sukusoluista, vaan ne saatiin alkion kappaleista eristetyistä soluista. Siksi on mahdollista, että ne ovat pluripotenttien, mutta jo sitoutuneiden solujen jälkeläisiä.

On huomattava, että EG-solujen ja primaarisukusolujen välillä on perustavanlaatuisia eroja. Jälkimmäiset eivät mahdollista kimeeristen hiirialkioiden saamista, mikä osoittaa primaarisukusolujen kyvyttömyyttä integroitua sisäiseen solumassaan tai trofektodermiin. Primaarisukusolupopulaation ominaisuudet ovat samankaltaisempia kuin myöhempien alkioiden somaattisten solujen sitoutuneet linjat, joiden lisääminen blastokystaan ei myöskään johda kimeeristen alkioiden muodostumiseen.

EG-solujen aggregaatiolla saatujen alkionkappaleiden viljelytekniikan muokkaaminen mahdollisti toisenlaisen pluripotenttien solujen populaation, nimeltään "alkionkappaleista peräisin olevat solut" (EBD-solut), saamisen käyttämällä valintaa selektiivisillä elatusalustoilla. EBD-solujen kyky lisääntyä viljelmässä pitkään mahdollisti vakaiden solulinjojen luomisen sitoutuneista soluista. Saatiin klooneja soluista, jotka ilmensivät laajan valikoiman erikoistuneiden solujen mRNA- ja proteiinimarkkereita. Tämä lähestymistapa osoitti lopulta, että ihmisen primaariset sukusolut ovat pluripotentteja ja erilaistuvat in vitro eri solutyypeiksi: neuroneiksi, neurogliaksi, verisuonten endoteeliksi, hematopoieettisiksi soluiksi, lihas- ja endodermaalisoluiksi.

Vaihtoehtoisia alkion kantasolujen lähteitä

Vaihtoehtoinen ihmisen alkion kantasolujen lähde voi olla hybridisolut. Heterogeenisen rakenteen istuttaminen pseudotiineyden omaavien lehmien kohtuun. Tämä rakenne on saatu fuusioimalla ihmissikiön somaattisia soluja elektroporaatiolla lehmän munasoluun, josta protuma on aiemmin poistettu. Tämä mahdollistaa sisäisen solumassan saamisen implantaatiota edeltävässä kehitysvaiheessa olevasta keinotekoisesta alkiosta. Tätä varten ensimmäisessä vaiheessa blastokysti saadaan lehmän munasolusta, johon on siirretty ihmissolun tuma.

Toisessa vaiheessa blastokystista eristetään alkioblasti, josta alkion kantasolut (ESC) eristetään Thomsonin menetelmällä. On huomionarvoista, että parhaat tulokset ESC-linjojen eristämisessä tällä menetelmällä saatiin käyttämällä follikkelisolujen tai primaaristen sukusolujen tumia, jotka ovat ihmiskehossa horrostilassa. Tämä johtuu siitä, että lehmän munasoluun siirrettyjen ihmissolujen tumien telomeerien ei tule olla lyhentyneet ja telomeaasiaktiivisuuden on oltava korkea, mikä auttaa välttämään hybridimunasolusta saatujen ESC-kloonien ennenaikaista ikääntymistä (Repin, 2001). Tiedetään, että ESC-solujen tärkeimmät solunsisäiset markkeriproteiinit ovat Oct3, Oct4, Tcf ja Groucho, jotka kuuluvat niin kutsuttuihin kromatiinin vaimentajaproteiineihin. Vaimentajat tarjoavat erityisen kompaktin heterokromatiinin paketin, joka estää eukromatiinisilmukoiden muodostumisen. Näiden proteiinien välittämä kromatiinin pakkaaminen korreloi ESC-genomin totipotenssin kanssa. Tähän mennessä on osoitettu, että kypsät naudan ja ihmisen munasolut ovat ainoa erikoistunut solutyyppi, joka sisältää suuria pitoisuuksia vaimentajaproteiineja sytoplasmassa. Tämän pohjalta kehitettiin menetelmä hybridi-esonaalisolujen saamiseksi siirtämällä somaattisten solujen tumat enukleoituihin naudan munasoluihin. Alustavat in vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että naudan munasolujen sytoplasma palauttaa ihmisen somaattisten solujen tumien genomin totipotenssin 12–24 tunnin viljelyn jälkeen.

Erityisen kiinnostavia ovat tiedot ihmisalkioiden preimplantaatiokehityksen erityispiirteistä, jotka viittaavat totipotenttien solujen korvautumiseen pluripotenttien solujen populaatiolla myöhempään kuin hiirillä. Solutransformaatioiden tutkimus osoitti, että trofoblastisoluja syntyy myös ihmisen blastokystien sisäisen solumassan soluista alkion kantasolujen lisäksi, mikä osoittaa niiden kokonaispotentiaalin.

Tiedetään, että blastokystan vaiheessa syntyy kaksi eri tavoin sitoutunutta solupopulaatiota. Toinen niistä muodostaa blastokystan ulkokerroksen - trofektoderman, jonka johdannaisia ovat trofoblastisolut ja muut istukan alkion komponentit. Toinen solupopulaatio on ryhmittynyt tiheäksi massaksi, joka on kosketuksissa trofektodermin sisäpinnan kanssa. Sisäisen solumassan solupopulaation johdannaiset ovat kaikki alkion elinten kudoksia ja alkeisosia. Myöhäisen blastokystan vaiheessa sisäisestä solumassasta muodostuu ekstraembryoninen endodermi ja epiblasti (primaarinen ektodermi). Tässä tapauksessa epiblastisolut säilyttävät pluripotenssin, kun taas kyky erilaistaa ekstraembryonisen endodermin soluja on rajallinen.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Ihmisalkion kantasolujen hankkiminen

Vielä vähän aikaa sitten uskottiin, että alkion kantasoluja oli mahdotonta saada trofoblasteista. Blastokystasta eristetty diploidinen trofektodermikantasolulinja kuitenkin lisääntyy ja muuttuu kantasoluiksi elatusaineessa, joka sisältää FGF2:ta ja hepariinia LIF:n sijaan. Jos FGF2 poistetaan elatusaineesta, trofektodermisolujen lisääntyminen lakkaa, niissä alkaa kromosomien endoreduplikaatio ja trofektodermin soluelementit muuttuvat vähitellen jättiläismäisiksi trofoblastisoluiksi. Todennäköisesti LIF ei stimuloi trofektodermisolujen lisääntymistä, koska FGF2 laukaisee erilaisen transsignalointimekanismin, koska plasman reseptoriin (FGFR2) sitoutuessaan FGF2 aktivoi sytoplasmassa olevat MAP-kinaaseja - ERK1:n ja ERK2:n. Näin ollen, kun yksi signalointireitti (LIF - gpl30 - JAK-kinaasi - STAT3) kytkeytyy päälle blastokystan soluissa, sisemmän solumassan solut muuttuvat pluripotenteiksi ESC-soluiksi, ja kun toinen transmembraanisen signaalitransduktion mekanismi (FGF2 - FGFR2 - MAP-kinaasi ERK1/ERK2) aktivoituu, blastokystaan muodostuu trofektodermin kantasoluja. Signalointireitin valinta puolestaan riippuu oct4-geenin aktiivisuudesta. Tämä POU-domeeniin kuuluva geeni sijaitsee autosomin 17 t-lokuksessa ja sitä ilmentyy oogeneesin aikana, pilkkoutumisvaiheen aikana sekä blastokystan sisemmän solumassan soluissa ja primaarisissa sukusoluissa. Oct4-geenin toiminnallinen rooli on koodata transkriptiotekijää, joka on välttämätön pluripotenttien solujen syntymiselle, niiden erilaistumiselle ja dedifferentiaatiolle.

Oct4-geenin ilmentyminen alkion kantasoluissa vaihtelee tämän transkriptiotekijän ja kofaktorien vuorovaikutuksen mukaan. Oct4:n ilmentymisen suunnattu säätely blastokysteissa osoitti, että kun sen aktiivisuus vähenee, puolet soluista muodostaa trofektodermia, kun taas kun oct4:n indusoitu ilmentyminen lisääntyy, syntyy pääasiassa alkion kantasoluja.

Kokeessa alkion kantasoluja ei voida siirtää solulinjaan totipotenttien blastomeerien viljelyn aikana alkion jakautumisvaiheessa, samoin kuin gastrulaatiovaiheessa ja alkionkehityksen myöhemmissä vaiheissa. Hiiren alkion kantasolut eristetään yleensä tiineyden 3,5–4,5. päivänä, mikä vastaa normaalin alkionkehityksen kuudetta (yksikerroksinen blastokysta) ja seitsemättä vaihetta (kaksikerroksinen blastokysta - varhainen munasylinteri). On selvää, että vasta implantaatiota edeltävällä ajanjaksolla hiiren alkiot sisältävät solupopulaatioita, jotka kykenevät transformoitumaan alkion kantasoluiksi. Näin ollen alkion kantasolujen linjojen eristäminen on mahdollista vain tietyissä alkionkehityksen vaiheissa. Hajoamisen aikana syntyvä tsygootti ja blastomeerit ovat totipotentteja elinkelpoisen alkiosolukalvojen ja istukan kanssa kehittymisen kannalta. Sukusolujen kokonaispotentiaalin menetys alkaa myöhäisessä morulavaiheessa, jolloin blastomeerien jatkokehitys riippuu niiden sijainnista. Varhaiset morulablastomeerit säilyttävät totipotenssin, koska kokeelliset manipulaatiot niiden lokalisoinnin muutoksilla, kuten sijainnin kääntäminen, eivät estä täysimittaisen alkion kehittymistä.

On todettu, että alkion kantasolulinjojen eristämisen tehokkuuteen vaikuttaa blastokystojen tila niiden poistohetkellä. Blastokystojen käyttö seitsemän päivän diapaussin mallintamisen jälkeen hiirien lisääntymiskanavassa, joille munasarjat on poistettu tiineyden 3,5. päivänä ja joille on annettu progesteronia, helpottaa alkion kantasolulinjojen eristämistä. Oletetaan, että tällaisissa olosuhteissa sisäisen solumassan muodostavien blastomeerien määrä kasvaa. On myös mahdollista, että solusykli pidentyy ja useimmat blastomeerit siirtyvät G0-vaiheeseen.

Lisäksi stabiilien pluripotenttien ESC-linjojen luominen riippuu alkioiden genotyypistä: ESC:t on melko helppo eristää 129 hiiren linjan blastokystoista, niitä on paljon vaikeampi saada käyttämällä CS7BL/6-hiiriä, ja ESC-linjan eristäminen CBA/Ca-hiirten blastokystoista on käytännössä mahdotonta. Varhaisilla alkioilla on ilmeisesti joitakin geneettisiä piirteitä, jotka vaikuttavat pluripotentin ESC-linjan kehitykseen. Siitä huolimatta eristettyjä epiblasteja viljeltäessä sekä erilaistuvien solujen selektiivisellä valinnalla ESC-linjoja eristettiin CBA/Ca-hiirten varhaisista alkioista.

Todistettu standarditekniikka alkioiden kantasolujen (ESC) saamiseksi blastokystoista on esitetty laboratoriokäsikirjoissa, jotka käsittelevät varhaisten alkioiden kokeita. Kokeellisia ESC-linjoja voidaan saada myös viljelemällä 4,5 päivän ikäisten hiirialkioiden eristettyä epiblastia (primaarista ektodermia) melko monimutkaisella mikrokirurgisella tekniikalla ja modifioiduilla viljelyolosuhteilla. Tämän toimenpiteen työläs vaatimus on perusteltu, koska ESC-linjojen muodostumistiheys osoittautui tässä tapauksessa huomattavasti suuremmaksi kuin blastokystan sisäisen solumassan kanssa tehdyissä töissä.

ESC-linjojen eristämiseksi jokainen klooni siirretään mikrokuoppaan, kasvatetaan 40–60 solun aggregaatti ja dispergoidaan sitten uudelleen. Tämän toimenpiteen useat toistot mahdollistavat kuolemattomien ESC-solujen saamisen, joilla on normokaryotyyppisten solujen maksimaalinen lisääntymisnopeus muoviin kiinnitettynä, ja jotka säilyttävät totipotenssin ja korkean telomeraasiaktiivisuuden 50–100 jakson jälkeen. ESC-linjojen ylläpitoprosessissa suurin vaara on elatusaineen tai seerumin kontaminaatio bakteerien endotoksiineilla – jo pienetkin endotoksiinipitoisuudet elatusaineessa aiheuttavat epäkypsien sukusolujen massakuoleman. Lineaarisen kasvun huolellisella seurannalla ja oikea-aikaisella dispergoinnilla ESC-solut viljelmässä kykenevät symmetriseen jakautumiseen, jossa molemmat tytärsolut pysyvät pluripotentteina ja kykenevät suorittamaan rajattoman määrän solusyklejä säilyttäen diploidisen karyotyypin ja kokonaispotenssin.

Puhtaan ihmisen alkion kantasolujen (ESC) populaation valinta voidaan suorittaa sen jälkeen, kun niiden genomi on transfektoitu rekombinantti-DNA-molekyyleillä, jotka sisältävät vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) synteesiä koodaavan geenin. GFP:n ilmentyminen lisääntyy, kun ESC:itä kasvatetaan olosuhteissa, jotka tukevat niiden lisääntymistä, kun taas erilaistumisen alkaessa tämän geenin ilmentymistaso laskee, mikä mahdollistaa puhtaiden, stabiilien pluripotenttien solulinjojen valinnan selektiivisellä alustalla. Kun viljellään GFP-valinnalla eristettyjä ESC:itä, pesäkkeiden muodostumistiheys moninkertaistuu, koska erilaistuneiden solujen voimakas lisääntymistä estävä vaikutus eliminoituu valintaviljelmien olosuhteissa.

Ihmisalkion kantasolujen translaatio solulinjaksi suoritetaan eristämällä ne implantaatiota edeltävistä alkioista (80–120 solun vaiheessa), jotka jäävät jäljelle koeputkihedelmöityksen jälkeen. Tätä varten keinotekoisesti saadut ”ylimääräiset” alkiot dispergoidaan mekaanisesti Delbecco-Eagle-elatusaineeseen. Kun solut on merkitty selektiivisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla, joissa on fluoresoiva merkki, alkion blastisolut eristetään. Alkio blastisolut dispergoidaan yksittäisiksi soluiksi dispaasi-kollagenaasiseoksen avulla. Erotettuja soluja kasvatetaan erityisessä elatusaineessa (80 % Delbeccon elatusainetta + 20 % vasikan sikiön seerumia 500 μg/ml IL-6:n, LIF:n ja SCF:n läsnä ollessa) kolmen ensimmäisen jakson alkion fibroblastien syöttösolukerroksen päällä. Tässä tapauksessa kantasolujen ja progenitorisolujen selviytyminen ja lisääntyminen säilyvät IL-6:n, LIF:n ja SCF:n vaikutuksesta. Tällaisessa elatusaineessa alkion kantasolut kasvavat kiinnittymättömien, pallomaisten solujen suspensioklooneina, jotka on dissosioitava pehmeällä, toistuvalla pipetoinnilla. Uusia klooneja ilmestyy suspensioviljelmään 5.–7. päivänä. ESC-solujen maksimaalinen kasvunopeus saavutetaan kloonien toistuvalla dissosiaatiolla 10–15 solun vaiheessa. Sitten jokainen klooni siirretään mikrokuoppaan ja kasvatetaan 40–50 solun aggregaatiksi. Toimenpide toistetaan useita kertoja siirrostuksissa, jolloin viljelmän tilavuus kasvaa 5–10 miljoonaan soluun 6 cm:n maljaa kohden. Tällaisten siirrostusten avulla Thomson eristi 10 kuolematonta ihmisen ESC-kloonia, jotka 100 siirrostuksen jälkeen säilyttivät korkean telomeraasiaktiivisuuden, kyvyn lisääntyä voimakkaasti, minimaaliset fenotyyppiset ominaisuudet ja täydellisen tehon sekä kyvyn erilaistua mille tahansa 350 erikoistuneesta solulinjasta, jotka ovat peräisin ekto-, meso- ja endodermista. Ihmisen ESC-solujen erilaistuminen alkoi (väliaineen vaihdon, seerumin lisäämisen ja LIF:n poistamisen jälkeen) solujen kiinnittyessä substraattiin, mikä osoittaa sytoskeletonin kehittymistä ja adheesioreseptorien ilmentymistä. Tärkeää on, että rajoittamattoman proliferaation myötä ihmisen ESC-solut säilyttivät normaalin karyotyypin.

Toinen menetelmä ihmisen alkion kantasolujen (ESC) eristämiseksi perustuu primaaristen sukusolujen käyttöön. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että E-solulinjoja voidaan saada 12,5 päivän ikäisten hiirialkioiden sukupuolielinten poimuista. Näissä tapauksissa progenitorisolulinjojen muodostumistiheys oli kuitenkin merkittävästi pienempi kuin aikaisempien alkioiden kokeissa. Samaan aikaan 13,5 päivän ikäisten hiirialkioiden sukurauhasista peräisin olevat primaariset sukusolut eivät kykene lainkaan muuntautumaan linjoiksi.

Ensimmäiset stabiilit pluripotenttien ihmisen EG-solujen linjat saatiin 5–9 viikon ikäisten alkioiden sukurauhasista eristetyistä primaarisista gonasoluista. Eristettyjä soluja viljeltiin inaktivoitujen hiiren alkion fibroblastien alustalla DMEM-elatusaineessa, johon oli lisätty sikiöseerumia merkaptoetanolilla, forskoliinilla ja rekombinanteilla ihmisen kasvutekijöillä (FGF ja LIF). 7–12 päivän kuluttua viljelmään ilmestyi monisoluisia pesäkkeitä, jotka vastasivat ihmisen EG-soluja morfologisten ominaisuuksien ja molekyylimarkkereiden perusteella. Aggregaation jälkeen näistä soluista muodostui alkiorakenteita, joiden jatkokehityksen myötä ilmestyi erikoistuneita soluja, jotka olivat tyypillisiä kaikkien kolmen alkiokerroksen johdannaisille. 10–20 jakson aikana EG-solulinjat säilyttivät normaalin karyotyypin eivätkä menettäneet pluripotenssia.

On myös osoitettu, että LIF:n, kalvoon sitoutuneiden ja liukoisten Steel-tekijöiden sekä TGF-b:n yhdistetty vaikutus muuttaa primaarisukusolujen kehitysohjelmaa. Sen sijaan, että mitoottinen jakautuminen loppuisi ja erilaistuminen oogeneesiin tai spermatogeneesiin alkaisi, primaarisukusolut jatkavat lisääntymistä. Useiden lisämitoosisyklien jälkeen niistä tulee epiblastisolujen kaltaisia ja ne menettävät sukusolujen esiasteiden ominaisuudet ja muuttuvat pluripotenteiksi alkion kantasoluiksi.

Niinpä vuonna 1998 eristettiin ensimmäistä kertaa kuolemattomia alkusukusolulinjoja ihmisen sikiön ruumiinavauskudoksen sukupuolielinten alkeellisuudesta. Ihmisen alkionkehityksessä alkusukusolut ilmestyvät ruskuaispussiin kolmannella kehitysviikolla, ja 4.–5. viikolla nämä solut siirtyvät sukupuolielinten tuberkuloosivyöhykkeelle, jossa ne muodostavat lepotilassa olevia primaaristen gonosyyttien populaatioita. Inaktiivisessa tilassa alkusukusolut säilyvät alkiossa syntymään asti. Alkusukusolulinjoja eristetään 5–9 viikon ikäisten alkioiden sukupuolielinten tuberkuloosista, ja uutettua kudosta käsitellään ex tempore kollagenaasien tyypin IV-V, hyaluronidaasin ja DNaasin seoksella solujen määrällisen ja laadullisen saannon lisäämiseksi. Sikiön sukupuolielinten tuberkuloosin kudoksessa olevia alkusukusoluja ympäröivät strooman (mesenkymaaliset) Sertolin solut. Sertolin solujen toiminnallinen tarkoitus on tuottaa antiapoptoottisia tekijöitä (Fas-ligandi), mitogeenejä ja immunosuppressantteja, jotka suojaavat sukusoluja elimistön immuunihyökkäyksiltä. Lisäksi sukupuolielinten tuberkuloosin stromaalisella mikroympäristöllä on tärkeä rooli sukusolujen kypsymisessä. Eristetyt primaariset sukusolut istutetaan viljelmään stromaalikerroksen päälle, joka koostuu kolmen ensimmäisen läpikulun sikiön fibroblasteista. Tehokkain mitogeenien yhdistelmä on kompleksi, joka koostuu LIF:stä, FGF:stä ja forskoliinista (cAMP:n muodostumisen stimulaattori). Primaaristen sukusolujen lisääntyminen in vitro vaatii sikiöseerumin lisäämistä, jonka läsnä ollessa primaaristen gonosyyttien lisääntymiseen viljelmässä liittyy pallomaisten solujen kloonien muodostuminen, jotka eivät ole kiinnittyneet substraattiin.

Yhdysvaltain kansallisissa terveyslaitoksissa (National Institutes of Health) tehtiin alustava johtopäätös, joka perustui yhteenvetoon olemassa olevista menetelmistä ihmisen alkion kantasolulinjojen eristämiseksi blastokystoista, ja siinä todettiin alustava johtopäätös, että alkion kantasolujen onnistunut eristäminen on todennäköisintä viljelemällä blastokystoja, joilla on hyvin muodostunut sisäinen solumassa (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health USA). Tästä näkökulmasta optimaalinen alkion kantasolujen lähde linjojen luomiseksi ovat ihmisen blastokystit viidentenä kehityspäivänä, joista trofektodermi tulee poistaa huolellisesti sisäistä solumassaa eristettäessä. Eristetty sisäinen solumassa, joka tässä vaiheessa koostuu 30–35 solusta, tulisi viljellä alkion hiiren fibroblastien alustalla, mikä on ratkaiseva edellytys alkion kantasolupesäkkeiden muodostumiselle viljelmässä.

Alkion kantasolujen fenotyyppisten ominaisuuksien analyysi

Erityisen kiinnostavaa on alkion kantasolujen fenotyyppisten piirteiden lajien välinen vertaileva analyysi. Havaittiin, että ihmisen alkion kantasolupesäkkeet ovat tiheitä, litistyneiden, epiteelin kaltaisten solujen ryppäitä, kun taas hiiren alkion runko koostuu löyhästä, pyöreiden solujen konglomeraatista. Ihmisen alkion kantasoluissa tuma-plasma-suhdeluku on alhaisempi kuin hiiren alkion kantasoluissa. Apinoiden alkion kantasolut muodostavat litteämpiä, epätasaisia solupesäkkeitä. Yksittäiset solut ovat helposti havaittavissa kädellisten alkion kantasolujen varhaisissa klooneissa. Kaikkien tutkittujen eläinlajien lisääntyvät alkion kantasolut eivät ilmennä MHC-luokan I ja II molekyylejä. Samaan aikaan ihmisen alkion kantasolut reagoivat positiivisesti TERA 1-60- ja GCTM-2-vasta-aineisiin, mikä osoittaa keratiini/kondroitiinisulfaattiproteoglykaanien läsnäoloa niiden pinnalla, mikä on tyypillistä alkio-(terato)karsinoomakantasoluille. Oct4-geenin ilmentyminen kaikkien eläinlajien alkion kantasoluissa viittaa siihen, että fenotyyppisistä eroista huolimatta sama pluripotenssin ylläpitämisestä vastaava geenijoukko on ilmeisesti aktivoitunut ihmisen ja hiiren alkion kantasoluissa (Peru, 2001). Lisäksi rotan, sian, kanin, kädellisen ja naudan alkioista eristetyillä ESC-linjoilla on samankaltaiset morfologiset ominaisuudet, samanlainen joukko molekyylitunnistusmarkkereita ja lähes identtinen molekyylimekanismi alkionkehitysohjelmien toteuttamiseksi, mikä antaa meille mahdollisuuden tarkastella ksenotransplantaation ongelmaa uudella tavalla.

Toisin kuin normaalissa alkionkehityksessä in vivo, alkion kantasolujen lisääntyminen in vitro ei tapahdu alkiokerrosten muodostumisen myötä, ja se tapahtuu homeoottisten Hox-geenien estymisen taustalla eli ilman organogeneesiä. Koska segmentointigeenit eivät toimi, alkionkehitysvaiheita, kuten somiittien munimista, alkion segmentoitumista, ruskuaispussin, allantoisin ja muiden väliaikaisten elinten ja kudosten muodostumista, on mahdotonta toistaa alkion kantasoluviljelmässä. Viljellyt alkion kantasolut näyttävät jäätyneen 350 erikoistuneiden solujen restriktiolinjan muodostumisprosessin alkuvaiheeseen. Siten tytärkantasolujen klooni ja keskeisesti lokalisoitunut alkion kantasolu edustavat vain alkion mallia, jonka kehityksen aikana eri kudosalueille muodostuu samanaikaisesti eri erikoistuneiden solujen linjoja, jotka kuitenkin ovat peräisin yhteisistä esiasteista. Huolimatta alkion kantasolujen pinnalla olevien reseptorien minimaalisesta määrästä, ne säilyttävät kyvyn suorittaa primitiivisiä morfogeneettisiä prosesseja jäljittelemällä varhaisen alkion volumetrisia rakenteita: alkion kantasolujen suspensio viljelmäaggregaateissa muodostaa rakenteita, jotka muistuttavat blastokystoja tai jopa myöhempiä alkioita (munasylinterit). Tällaisia suspensioaggregaatteja kutsutaan vastaavasti yksinkertaisiksi ja monimutkaisiksi alkion kappaleiksi.

Sekamuotoisessa erilaistumisessa ektodermin (oct3, fgf-5, nodaali), endodermin (gata-4), mesodermin (brachyury), kardiogeenisen mesodermin (pkh-2.5), hermostoputken (msx3) ja hematopoieesin (elkf) varhaisia geenejä ilmennetään samanaikaisesti saman alkion eri soluissa. Käyttämällä erilaisia kasvutekijöiden ja sytokiinien yhdistelmiä kohdennettuun vaikutukseen sukusolujen muodostumiseen in vitro, useissa tapauksissa oli mahdollista saada alkion runkoja, joissa ilmentyi ensisijaisesti ektodermi- tai mesodermigeenejä, mikä avaa tien gastrulaation ja organogeneesin alkuvaiheiden mallintamiselle.

Alkiosolujen klonaalinen kasvu on osoitus epäsymmetrisestä solujakautumisesta, jossa vain yksi kloonin keskellä oleva alkion kantasolu säilyttää rajattoman lisääntymispotentiaalin, kun taas toinen tytärsolu tuottaa sukupolven progenitorisoluja, jotka ovat jo erilaistumassa. Siksi kloonin lisääntymisnopeus alkion kehon reunalla on korkeampi kuin keskellä. Kasvavan kloonin reunasolut erilaistuvat spontaanisti epäjärjestyneesti, migraationopeus tai kuolevat apoptoottisten mekanismien kautta. Nämä tapahtumat määräävät kloonin kohtalon: jos lisääntymisnopeus ylittää migraatio- ja apoptoottisen solukuoleman nopeuden, klooni jatkaa kasvuaan, vakautuminen tapahtuu, kun apoptoosinopeus ja uusien solujen muodostumisnopeus ovat yhtä suuret, ja regressio tapahtuu, kun näiden prosessien suhde on käänteinen. Progenitorisolut jakautuvat symmetrisesti, eli molemmat tytärsolut erilaistuvat myöhemmin kypsiksi erikoistuneiksi solulinjoiksi. ESC-solujen ja progenitorisolujen suhde vaihtelee, mutta ESC-solujen lukumäärä on aina vain murto-osa prosentista progenitorisolupopulaatiosta. Siksi vain huolellinen pipetointi ja kloonien oikea-aikainen hajottaminen voivat lisätä ESC-solujen määrää viljelmässä. Kloonien hajottaminen 10–12 solun vaiheessa osoittautui tehokkaimmaksi menetelmäksi alkion kantasolujen maksimaalisen saannon saavuttamiseksi. Alkion solujen erilaistumisen suunta ja aste alkion kehossa riippuvat niiden sijainnista. Alkion ulommat solut eivät ilmennä oct4-geeniä ja erilaistuvat primaarisen endodermin soluiksi, joista myöhemmin muodostuu epiteelin kaltaisia parietaalisen ja viskeraalisen ekstraembryonaalisen endodermin soluja. Alkion ulommat solut ilmentävät oct4-geeniä ja säilyttävät pluripotenssin 48 tunnin viljelyn ajan. Viljelmä kuitenkin järjestyy morfologisesti uudelleen epiteelimonokerrokseksi ja primaarisen ektodermin kehitystä säätelevien geenien ilmentyminen alkaa. Seuraavaksi alkaa täydellisen epäjärjestyneen soludifferentiaation prosessi, kun ilmaantuu erilaisia solutyyppejä, jotka ovat peräisin kaikista kolmesta alkiokerroksesta. Alkion solujen spontaanin erilaistumisen prosessissa ensimmäisinä ilmestyy aggregaatteja, joissa on endodermimarkkereita ruskuaispussin fragmenttien (kystojen) muodossa. Sitten näihin rakenteisiin ilmestyy kasvavien kapillaarien angioblasteja ja endoteelisoluja. Spontaanin erilaistumisen loppuvaiheissa alkion sisäisistä soluista kehittyy erilaisia terminaalisesti erilaistuneita soluja, mukaan lukien neuroneja, gliaelimiä, sydänlihassoluja, makrofageja ja punasoluja. Tietyssä määrin (ottaen huomioon germinaalikudoskerrosten muodostumisen spatiaalisen inversion) alkionkappaleiden avulla on mahdollista tutkia morfogeneettisiä prosesseja in vitro ja analysoida alkion sytodifferentiaation alkuvaiheiden molekyylimekanismeja.sekä selvittää tiettyjen geenien rooli näiden prosessien toteuttamisessa.

Kloonin sisällä on siis soluja, joissa on löydetty erilaisia geneettisiä kehitysohjelmia - alkion kantasoluja, varhaisia progenitoreita ja erilaistuvia kantasolupopulaatioita. Alkiokantasolujen viljely ripustuspisaroilla tai massaviljelymenetelmillä ilman ravintokerrosta ja LIF:n lisäämistä kasvualustaan johtaa väistämättä alkiokappaleiden muodostumiseen. Alkiokappaleiden ulko- ja sisäkerroksen solujen morfologia eroaa toisistaan. Ulkokerros koostuu suurista, haarautuneista soluista. Niiden ympäristöön päin oleva pinta on peitetty lukuisilla mikrovilluksilla. Solujen ulkokerros on erotettu sisäkerroksesta Reichertin kalvoa muistuttavalla tyvikalvolla, kun taas alkiokappaleiden sisäkerroksen solut ovat pylväsmäistä epiteeliä. Morfologisesti sisäkerros, vaikka se sisältääkin paljon jakautuvia soluja, muistuttaa enemmän erilaistumattomia alkion kantasolupesäkkeitä.

Ihmisalkion kantasolujen ominaisuudet

Parenkymaalisten ja mesenkymaalisten signalointivuorovaikutusten puuttuminen homeoosigeenin estämisen taustalla johtaa alkion kantasolujen (ESC) epäjärjestyneeseen kasvuun viljelmässä, koska tämä häiritsee väliaikaisten elinten infrastruktuurin muodostumista ja kehitystä. ESC:iden epäjärjestynyt kasvu ja epäjärjestynyt spontaani erilaistuminen viljelmässä johtuvat tulevien elinten stroomarakenteen mesenkymaalisen merkinnän puuttumisesta: in vitro on täysin mahdollista muodostaa miljoonia maksasoluja, mutta on mahdotonta saada yhtä maksalohkoa, joka sisältäisi sellaisia rakenteellisia ja toiminnallisia elementtejä kuin poskiontelot, Disse-tilat ja Kupfferin solut.

Uskotaan, että alkion kantasolujen pluripotenssi toteutuu yksinomaan alkionkehityksessä alkion kudosten ja elinten muodostuessa, kun taas istukka ja napanuora ovat trofoblastien johdannaisia. Trofektodermaalikalvoon suljetut alkion kantasolut tuottavat peräkkäin väliaikaisten solujen klooneja, jotka toteuttavat kehitysohjelmaa Nokhtejovin volumetrisen topografisen matriisin kombinatorisen mRNA:n kautta. Nämä kloonit määräävät ennalta väliaikaisten ja lopullisten elinten solujen spatiaalisen järjestelyn, muodon ja koon, lukumäärän sekä parenkyymin kokoonpanon rakenteelliseksi ja toiminnalliseksi yksiköiksi. Samaan aikaan alkion kantasolut ovat ainoa solutyyppi, jossa niiden potenssien toteuttamiseen tarkoitettu molekyylimekanismi on täysin irrotettu geneettisestä kehitysohjelmasta, ja itse alkion kantasoluilta puuttuu kyky olla vuorovaikutuksessa muiden solujen kanssa sekä reseptorien havaintojen että transsignalointijärjestelmien estymisen vuoksi. Alkion kantasolujen riittävä aktivointi johtaa kuitenkin alkionkehitysohjelman vaiheittaiseen kehitykseen, joka päättyy täysin muodostuneen organismin syntymään, joka koostuu miljardeista soluista ja on valmis kohdun ulkopuoliseen elämään. Tällä lyhytaikaisella, mutta käsittämättömän pitkällä matkalla solutilassa syntyy väistämättä virheitä sekä solujen elintärkeää toimintaa varmistavissa molekyylimekanismeissa että niiden lisääntymistä, erilaistumista ja erikoistumista kontrolloivissa ohjelmissa. Siksi nykyaikaisessa farmakogenomiikassa molekyylirakenteen sairauksia ja soluohjelmoinnin sairauksia tarkastellaan erikseen. Lisäksi useimpien uusien lääkkeiden vaikutus kohdistuu erilaistumisen, lisääntymisen ja organogeneesin ohjelmien korjaamiseen sekä elinten ja kudosten uudistumiseen. Aikuisen organismissa alkion kantasolut mahdollistavat aivoihin, maksaan, pernaan, luuytimeen ja muihin ihmisen elimiin siirrettyjen kanta-/progenitorisolujen käyttäytymisen kontrolloinnin vastaanottajan elinten vaurioituneen parenkyymin palauttamiseksi erilaistumalla ja erikoistumalla luovuttajasoluihin säilyneellä mesenkymaalisella matriisilla. Pohjimmiltaan totipotenssiohjelma alkaa toteutua munasolun, tsygootin ja blastomeerin genomien tasolla; näitä soluja ei kuitenkaan ole vielä kloonattu ja jalostettu kokeellisen ja käytännön lääketieteen tarpeisiin tarvittavissa määrin. Siksi alkion kantasolut ovat edelleen ainutlaatuinen geneettisen tiedon lähde, joka sisältää koodeja alkion kolmiulotteiselle kartalle ja koodeja erikoistuneiden solulinjojen lineaariselle restriktiolle gastrulaation aikana.

ESC-solujen käytännössä rajaton regeneratiivinen potentiaali johtuu siitä, että niiden genomi, toisin kuin erilaistuneiden somaattisten solujen geneettinen apuväline, säilyttää pluripotenssin. Yksi ESC-soluihin upotetun geneettisen informaation lepotilan ilmentymistä on niin sanottu minimaalinen fenotyyppi - ESC-solujen pinnalla ilmentyy rajallinen määrä reseptoreita, ja vastaavasti solun tumajärjestelmän ja sen mikroympäristön vuorovaikutukseen käytetään hyvin vähän transsignalointiohjelmia. Erikoistuneiden solulinjojen rajoittamisesta ja solujen erilaistumisesta vastaavien geenien horroksen taustalla aktivoituu vain noin 30 500 geenistä, joiden tuotteet varmistavat solun yhteyden ympäröivään mikroympäristöön. Geeniekspression sarja-analyysimenetelmällä osoitettiin, että somaattisten solujen ja ESC-solujen energiaa ja aineenvaihduntaa säätelevien genomin pääfunktionaalisten laatikoiden yhteisen toiminnan myötä jälkimmäisillä on hyvin alhainen reseptorien, G-proteiinien, sekundaaristen lähettien, transkriptaasien, ilmentymis- ja repressiokofaktorien mRNA-taso, ts. koko säätelysignaalin soluun kulkeutumisen transmembraanijärjestelmä. Tämä johtuu transsignalointigeenien puuttumisesta tai hyvin alhaisesta ilmentymisestä. ESC-genomin indusoidun erilaistumisen aikana 18 toimivaa geeniä lakkaa synkronisesti toimimasta 61 transsignalointigeenin aktivoitumisen taustalla. Nämä geenit säätelevät soluadheesioreseptorien, solunulkoisen matriisin komponenttien, restriktiotranskriptaasien ja signaalinsiirtojärjestelmän lähettielementtien synteesiä soluplasmakalvon reseptoreista tumalaitteeseen. Samalla estetään vaimentavaproteiinien synteesistä vastaavien geenien ilmentyminen, samoin kuin geenien ilmentymisen koinhibiittorien, jotka varmistavat ESC-genomin totipotenssin, ilmentyminen.

Geenimarkkereita on löydetty kaikkien kolmen alkiokerroksen soluille. Ektodermaalisolukerroksen tunnistaminen tapahtuu nodaali-, oct3- ja fgf-5-geenien ilmentymisen perusteella, mesodermisolut brachyury- ja zeta-globiinigeenien perusteella ja endodermi gata-4-geenin ilmentymisen perusteella. Normaalissa alkionkehityksessä gastrulaatiovaiheessa havaitaan kantasolujen ja progenitorisolujen epäkypsien populaatioiden aktiivista migraatiota, joka merkitsee paikallisesti kallon kasvojen luiden, joidenkin aivojen osien, perifeerisen hermoston, sydämen johtumisjärjestelmän ja kateenkorvan kehitysvyöhykkeitä, joiden kudokset muodostuvat migraattorisolujen klooneista. Solujen merkitseminen alkiokerrosten varhaisilla geeneillä helpottaa esiastesolujen migraatioprosessien topografista analyysiä kehittyvässä alkiossa. Erityisesti on todettu, että P19-alkiokarsinoomasolujen aggregaateissa ensimmäisen mesodermigeenin brachyury ilmentyminen alkaa kudosplasminogeeniaktivaattorin, a-fetoproteiinin, keratiini 8:n ja keratiini 19:n geenien vähentyneen ilmentymisen aikana, jotka ovat ensimmäisten migroivien mesodermipopulaatioiden markkereita. Näin ollen mesodermaalista alkuperää olevien kudosten muodostuminen alkaa vasta mesodermaalisten progenitorisolujen pistemigraatio- ja leviämisprosessin päättymisen jälkeen.

Vaikka ESC:t ovat erittäin rajallisia fenotyyppisiä piirteitä ja useimpien transsignalointiyksiköiden puuttumista, ne ilmentävät edelleen joitakin reseptorimolekyylejä, joita voidaan käyttää niiden tunnistamiseen. On huomionarvoista, että ESC-markkeriantigeenit ihmisillä ja kädellisillä osoittautuivat yleisiksi. Useimmiten ESC-leimaukseen käytetään leimattuja vasta-aineita kalvoon sitoutuneille antigeeneille SSEA-3, SSEA-4 (ainutlaatuiset lipidiantigeenit, jotka edustavat glykolipidi GL7:n ja siaalihapon kompleksia) sekä korkeapolymeerisille glykoproteiineille TRA-1-81, TRA-1-60. Lisäksi ESC:t ilmentävät spesifistä alkion antigeeniä SSEA-1 ja endogeenistä alkalista fosfataasia sekä spesifistä transkriptiotekijää Oct4. Jälkimmäinen on välttämätön ESC-proliferaatiomekanismien ylläpitämiseksi - spesifinen transkriptiotekijä Oct4 aktivoi fibroblastikasvutekijä 4 -geenin ilmentymisen ja stabiloi sen geeniryhmän ilmentymistä, joka vastaa rajoittamattomasta DNA:n replikaatiosta epäkypsissä soluissa. Tärkeimmät solunsisäiset markkeriproteiinit ovat Oct3, Oct4, Tcf ja Groucho, jotka ovat sukua kromatiinivaimentajaproteiineille.

Lähes heti vuosien jälkeen, kun yritykset viljellä alkion kantasoluja kehon ulkopuolella olivat onnistuneet ja ensimmäiset hiiren blastokystoista eristetyt kantasoluviljelmät ja primaaristen sukusolujen viljelmät oli saatu, aloitettiin tutkimusvaihe alkion kantasolujen pluripotenttista potentiaalista, kun ne vietiin alkioihin kehityksen alkuvaiheessa. Osoitettiin, että morula- ja blastokystivaiheessa alkion kantasolut kykenevät muodostamaan kimeerisiä alkioita, joissa luovuttajien alkion kantasolujen jälkeläisiä havaitaan kaikissa somaattisissa kudoksissa ja jopa sukusoluissa. Näin ollen kehitysbiologiassa alkion kantasolujen avulla luotiin "silta" kokeellisten in vivo- ja in vitro -tutkimusten välille, mikä laajensi merkittävästi mahdollisuuksia tutkia primaaristen kudosten ja elinten muodostumisprosesseja, niiden erilaistumista ja alkion organogeneesiä.

On selvästi osoitettu, että alkionkehityksen aikana alkion kantasolut (ESC) integroituvat in vivo varhaisen alkion solumassaan, ja niiden johdannaisia löytyy kaikista elimistä ja kudoksista. ESC:t kolonisoivat kimeerisen alkion sukusolulinjan, jonka jälkeläiset muodostavat täysivaltaisia munasoluja ja siittiöitä. Alkion kantasolut ovat klonogeenisiä - yksi ESC kykenee luomaan geneettisesti identtisen solupesäkkeen, jolla on molekyylimarkkereita, joihin kuuluvat oct4-geenin ja alkalisen fosfataasin ilmentyminen, korkea telomeraasiaktiivisuus ja tiettyjen alkion antigeenien ilmentyminen.

Alkionkehityksen mekanismien tutkimiseksi alkion kantasolujen avulla on kehitetty morulakimerisaatiomenetelmä luomalla biologinen konstruktio, jonka ulkopuolella on vastaanottajan tetraploidisten blastomeerien kerros ja sisään viedään luovuttajan alkion kantasoluja. Näin ollen trofoblasti muodostuu vastaanottajan tetraploidisten blastomeerien jälkeläisistä, mikä varmistaa implantaation ja istukan kiinnittymisen, ja luovuttajan alkion kantasolut toimivat sisäisenä solumassana, josta muodostuu elinkelpoisen alkion runko ja primaaristen kantasolujen linja. Alkion kantasolujen tutkimusarvo ei ole pelkästään siinä, että pluripotenssi säilyy niiden genomin in vitro -manipulaatioiden aikana, vaan myös siinä, että alkion kantasolujen kyky osallistua kimeerisen alkion primaaristen sukusolujen muodostumiseen säilyy. On osoitettu, että yhden geneettisesti muunnellun alkion kantasolun jälkeläiset asuttavat kaikki kimeerisen alkion primaariset alkeet ja kehittyvät kudokset, jotka on saatu aggregoimalla tai yhteisviljelyllä tämän solun ja 8-soluisen alkion välillä. Kun vihreän fluoresoivan proteiinin geenillä transfektoidut alkion kantasolut siirrettiin hiirten morulaan, tämän solun fluoresoivia jälkeläisiä löydettiin kaikista tutkituista kehittyvän alkion kudoksista (Shimada, 1999). Alkiokantasolujen siirtäminen morulaan mahdollistaa elinkelpoisten hiirten luomisen, joiden organismi koostuu vain luovuttajan alkion kantasolun jälkeläisistä, mikä avaa mahdollisuuksia erilaisille terapeuttisen kloonauksen vaihtoehdoille. Tätä metodologista lähestymistapaa käytetään nyt menestyksekkäästi kehitysbiologian ongelmien tutkimiseen, erityisesti X-kromosomin geneettisen inaktivaation tai alkion kantasolujen epigeneettisen epävakauden mekanismien analysointiin. Alkiokantasolujen siirtämistä varhaiseen alkioon käytetään myös maatalouden bioteknologiassa sekä geeniterapiakokeissa.

Geneettisesti muunneltujen alkion kantasolujen (ESC) siirtoa käytetään testaamaan mutanttigeenien kohdesoluja. Biotekniikassa in vitro -viljeltyjä ESC-soluja käytetään poistogeenisten hiirten luomiseen. Tätä varten tutkittava geeni poistetaan ESC-soluista homologisella rekombinaatiolla (poistogeeni) ja solut, joista tämä geeni puuttuu, eristetään selektiivisille elatusaineille. Poistogeeniset ESC-solut viedään sitten blastokystaan tai aggregoidaan morulablastomeereihin. Tällä tavoin saadut kimeeriset varhaiset alkiot siirretään vastaanottajanaaraisiin, ja vastasyntyneistä hiiristä valitaan yksilöitä, joilla on tietyn geenin suhteen nullitsygoottisia sukusoluja. Tätä tekniikkaa on käytetty luomaan monia poistogeenisten hiirilinjoja, joita käytetään laajalti kokeellisessa biologiassa ja kokeellisessa lääketieteessä. Tällaisia biologisia malleja käytetään tutkimaan tiettyjen geenien merkitystä alkionkehityksessä sekä niiden roolia ihmisen sairauksien ja patologisten tilojen mekanismeissa. Lisäksi poistogeenilinjoja käytetään uusien geeniterapiamenetelmien prekliinisissä testeissä. Esimerkiksi transfektoimalla mutanttigeenin normaali alleeli ESC-genomiin on mahdollista tehokkaasti korjata hematopoieettiseen järjestelmään vaikuttava mutaatio. Vieraiden geenien lisääminen alkion kantasoluihin mahdollistaa homotsygoottisten transgeenisten laboratorioeläinlinjojen nopean luomisen. On kuitenkin huomattava, että kohdennetun rekombinaatiogeenin deleetion tekniikkaa on toistaiseksi kehitetty luotettavasti vain hiiren alkion kantasoluihin liittyen. Hiiren alkion kantasolujen kaksoispoistogeenisillä menetelmillä määritettiin kromosomin 7 geeniklusterialueen (kopio ihmisen kromosomin 19 genomialueesta) ja kromosomin 11 proksimaalisen alueen (kopio ihmisen kromosomista 5g) toiminnallinen rooli. Näiden geenien deleetio hiiren alkion kantasoluissa mahdollisti niiden analogien toiminnan arvioinnin ihmisillä.

Ihmisen alkionkehityksen geenien toiminnan tutkimusmahdollisuudet ovat laajentuneet, ja niiden transfektointi laboratorioeläinten alkion kantasolujen genomiin on mahdollistanut erityisesti kryptogeenin roolin selventämisen kardiogeenisen mesodermin, pax-6-geenin, muodostumisessa ja kehityksessä silmän alkionkehityksessä. Ensimmäisiä karttoja geenien ilmentymisestä hiirien teratokarsinooman ja blastokystojen kypsymättömissä, lisääntyvissä alkion kantasoluissa laaditaan parhaillaan, ja transsignalointigeenien suppressiivinen repressio alkion kantasoluissa on vahvistettu. 60-80 mutanttialkiosolun ja 20-30 normaalin implantaatiota edeltävän hiiren alkion solun yhdistelmä johtaa kimeeristen alkioiden kehittymiseen, joissa elinalkiot koostuvat luovuttaja- ja vastaanottajasoluista, mikä mahdollistaa tuntemattomien geenien roolin selventämisen gastrulaatiossa ja organogeneesissä. Kehittyvien hiirialkioiden geenien toiminnallista karttaa täydennettiin tiedoilla sf-1-geenin roolista lisämunuaisen ja sukurauhasten muodostumisessa, wt-1-geenin roolista munuaisen muodostumisessa, myoD-perheen geenien roolista luustolihasten muodostumisessa sekä gata-1-4-perheen geenien roolista erytropoieesin ja lymfopoieesin alkeisrakenteiden restriktiokypsymisessä.

Äidin ja isän puolen geenien alleelien ohjattu poiskytkentä alkion kantasoluissa vektorirekombinaasien avulla mahdollisti eri geenien toimintojen selvittämisen alkionkehityksen alkuvaiheessa, ja tuntemattomien ihmisen geenien ohjatun siirron teknologia hiiren alkion kantasoluihin edistää uusien mutanttigeenien löytämistä, jotka ovat vastuussa vakavan perinnöllisen patologian kehittymisestä. Knockout-menetelmällä määritettiin joidenkin geenien pakollinen merkitys alkion kudosten muodostumiselle: gata-4 - sydänlihakselle, gata-1 - hematopoieettisen kudoksen erytroidilinjalle, myoD - luustolihaksille, brachyury - mesodermille, restriktiotranskriptaasit hnf3 ja hnf4 - maksan kantasoluille, rag-2 - T- ja B-lymfosyyttikloonien muodostumiselle (Repin, 2001). Geenien kaksinkertainen deleetio alkion kantasoluissa on avannut pääsyn alkiokerroksen geenien toiminnallisen roolin, segmentaation ja homeoosin tutkimukseen, ja alkion kantasolujen siirto on mahdollistanut elinkelpoisten lajien välisten hybridialkioiden saamisen. Käyttämällä parannettua tekniikkaa yksittäisen luovuttajan alkion kantasolujen siirtämiseksi 8-soluiseen alkioon on todistettu kimeerisoituminen monien vastaanottaja-alkion elinten solutasolla. On huomattava, että ihmiskudoksen soluversoja on löydetty vastaanottajahiirten elimistä sen jälkeen, kun ihmisen hematopoieettisia kantasoluja on tuotu blastokystaan. On todettu, että pluripotentteja alkion kantasoluja kiertää hiiren alkioiden veressä elinten muodostumisen aikana. On mahdollista, että niiden biologinen tehtävä on tulevan immuunijärjestelmän alkion organisoitumisessa. Alkiokantasolujen avulla on laboratorio-olosuhteissa luotu riittäviä malleja ihmisen geneettisestä patologiasta: dystrofiinigeenin kaksoispoisto mallintaa Duchennen lihasdystrofiaa hiirillä ja atm-geenin (kromatiinisignaalikinaasin synteesin säätelyä säätelevä geeni) sammuminen - ataksia-telangektasia. Tässä lasten kuolemaan johtavassa perinnöllisessä sairaudessa pikkuaivoissa Purkinjen solujen rappeutuminen kehittyy DNA:n korjausvirheiden vuoksi, johon liittyy kateenkorvan involuutio lisääntyvien solujen kuoleman vuoksi. Kimeerihiirten ataksia-telangektasian kliininen kuva, patofysiologia ja patomorfologia, jotka on toistettu lisäämällä patologista geneettistä tietoa ESC:hen, vastaavat ihmisten vastaavia. Ataksia-telangektasian lisäksi ESC:itä ja knockout-hiiriä käyttäen on kehitetty kokeellisia malleja joistakin perinnöllisistä homotsygoottisista ihmissairauksista, jotka liittyvät hiilihydraatti- ja lipidiaineenvaihdunnan patologiaan, aminohappojen kataboliaan sekä kuparin ja bilirubiinin erittymiseen, mikä on merkittävästi laajentanut kokeellisen lääketieteen mahdollisuuksia uusien hoitomenetelmien prekliinisessä testausvaiheessa vastaavien ihmissairauksien hoidossa.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Kantasolujen sytohybridien käyttö

Hybridisolut, jotka on saatu fuusioimalla ESC-soluja somaattisiin soluihin, ovat riittävä ja lupaava malli kantasolujen pluripotenssin tutkimiseen ja erilaistuneiden solujen kromosomien uudelleenohjelmointiin. Sytohybridit, jotka on saatu fuusioimalla ESC-soluja aikuisen eläimen erilaistuneisiin soluihin, mahdollistavat eri "ikäisten" genomien välisten suhteiden tutkimisen: ainutlaatuinen tilanne syntyy, kun eri erilaistumisvaiheissa ja eri kypsyysasteissa olevista soluista peräisin olevat homologiset kromosomit sijaitsevat samassa tumassa, jossa ne voivat helposti vaihtaa trans-vaikuttavia säätelysignaaleja. On vaikea ennustaa, miten yksilönkehityksen aikana muodostuneet homologisten kromosomien cis-säätelyepigeneettiset järjestelmät reagoivat alkion sukulaisista genomeista lähtöisin olevien trans-vaikuttavien signaalien vaikutukseen. Lisäksi hybridisoluissa tapahtuu vanhempien kromosomien segregaatiota, mikä antaa meille mahdollisuuden tutkia genomien vuorovaikutusta yksittäisten kromosomien tasolla, eli mahdollisesti tunnistaa tiettyjen kromosomien osallistuminen pluripotenssin ylläpitämiseen tai päinvastoin erilaistumiseen siirtymiseen.

Pluripotenttien teratokarsinoomasolujen ja erilaistuneiden somaattisten solujen fuusioinnista saatuja sytohybridejä käytettiin ensimmäisenä kokeellisena mallina tutkittaessa eri "kehityshistorioilla" varustettujen genomien vuorovaikutusta. Joissakin tapauksissa tällaiset hybridisolut säilyttivät pluripotenttiset ominaisuudet melko korkealla tasolla. Erityisesti in vivo teratokarsinooma-somaattiset hybridisolut indusoivat kaikkien kolmen alkiokerroksen johdannaisia sisältävien todellisten teratoomien kehittymistä, ja in vitro suspensioviljelmissä ne muodostivat alkiorakenteita. Jopa tämän tyyppisissä interspesifisissä sytohybrideissä alkioantigeenien läsnäoloa havaittiin tapauksissa, joissa somaattiset kumppanit teratokarsinoomasolujen fuusiossa olivat lymfosyyttejä tai tymosyyttejä. On huomionarvoista, että teratokarsinoomasolujen ja fibroblastien fuusiosta luodut sytohybridit vastasivat fenotyypiltään fibroblasteja.

Tärkein vakiintunut tosiasia on, että teratokarsinooma-somaattisissa hybridisoluissa ilmeni merkkejä erilaistuneen solun genomin uudelleenohjelmoinnista, jolle oli ominaista joko yksittäisten geenien tai somaattisen kumppanin inaktiivisen X-kromosomin uudelleenaktivoituminen. Näin ollen teratokarsinooma-somaattisen solutyypin sytohybrideillä tehtyjen tutkimusten tulokset osoittavat, että pluripotenssi usein säilyy hybridisoluissa ja on merkkejä somaattisen kumppanin genomin uudelleenohjelmoinnista.

Kokeissa, joissa saatiin lajinsisäisiä alkion hybridisoluja fuusioimalla hiiren alkion kantasoluja aikuisen pernan solujen kanssa, tutkittiin tällaisten sytohybridien ominaisuuksia, analysoitiin vanhempien kromosomien segregaatiota ja arvioitiin hybridigenomin pluripotenssia. Teratokarsinoomasolujen ja somaattisten solujen fuusioimalla saaduille lajinsisäisille hybridisoluille on yleensä ominaista alhainen kromosomien segregaatio tetraploidin tai lähes tetraploidin karyotyypin kanssa. Samanlainen kromosomikoostumus havaittiin sytohybrideissä primaaristen sukusolujen ja lymfosyyttien fuusioinnin aikana. Samaan aikaan hiiren teratokarsinoomasolujen ja minkkilymfosyyttien fuusioimalla saadut lajienväliset hybridisolut osoittivat somaattisen kumppanin kromosomien voimakasta segregaatiota.

Laadullisesti uusi vaihe vanhempien kromosomien segregaation tutkimuksessa intraspecifisissa hybrideissä alkoi sen jälkeen, kun kehitettiin menetelmä mikrosatelliittien analysoimiseksi polymeraasiketjureaktion avulla, jonka ansiosta löydettiin useita satoja markkereita jokaiselle hiiren kromosomille, mikä mahdollisti minkä tahansa homologisen kromosomiparin luotettavan erottelun hybridisoluissa.

Fuusioimalla ESC-soluja (HM-1-soluja, joilta puuttuu hypoksantiinifosforibosyylitransferaasiaktiivisuus, 2n = 40, XY, eristetty 129/01a-hiirten blastokysteista) kongeenisten DD/c-hiirten pernasolujen kanssa, oli mahdollista saada joukko hybridi-klooneja, jotka olivat morfologisesti samanlaisia kuin ESC-solut. Kaikki kloonit eristettiin selektiiviselle alustalle, jossa vain aktiivisen hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin omaavat solut voivat kasvaa. Elektroforeettinen analyysi osoitti, että kaikilla klooneilla oli DD/c-hiirille ominainen hypoksantiinifosforibosyylitransferaasin alleelivariantti. Sytogeneettinen analyysi osoitti, että kolmella neljästä hybridi-kloonista oli lähes diploidinen kromosomijoukko. Yksi lähes tetraploidinen klooni sisälsi kaksi hybridi-solupopulaatiota, joista toinen oli tetraploidi ja toinen, pienempi, oli diploidi.

Mikrosatelliittianalyysi, joka mahdollistaa minkä tahansa homologisen kromosomiparin erottelun hiirillä 129/01a ja DD/c lähes diploidisen sarjan omaavissa hybridiklooneissa, osoitti, että kahdessa kloonissa somaattisen kumppanin autosomit eliminoituivat selvästi ensisijaisesti. Useimmissa kloonien HESS2 ja HESS3 autosomeissa oli 129/01a-linjan eli pluripotentin kumppanin markkereita. Poikkeuksena olivat kromosomit 1 ja I: klooneissa HESS2 ja HESS3 oli HM-1-solujen markkerien ohella somaattisen kumppanin markkereita pieniä määriä. Tällaiset tulokset voivat heijastaa somaattisen kumppanin kromosomien 1 ja I epätäydellistä segregaatiota ja ovat yhdenmukaisia sytogeneettisten tietojen kanssa, joiden mukaan näiden kromosomien trisomia havaitaan 30–40 %:ssa kloonien HESS2 ja HESS3 soluista. Klooni HESS4 erosi merkittävästi kromosomikoostumuksensa suhteen: monet tämän kloonin autosomit olivat peräisin ESC-genomista (kromosomit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 ja 17), mutta kromosomeja 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 ja 19 edustivat molempien vanhempien homologit. Näitä homologisia kromosomeja merkitsevien mikrosatelliittien määrällinen suhde oli noin 1:1. Tämän ansiosta kirjoittajat saattoivat olettaa, että toinen homologi oli peräisin ESC-genomista ja toinen erilaistuneista soluista. Joissakin kloonin HESS4 alaklooneissa oli läsnä vain somaattisen kumppanin kromosomien 18 ja 19 markkereita. Saadut tulokset osoittavat, että HESS4-kloonin soluissa somaattisen kumppanin kromosomien segregaation lisäksi tapahtui pluripotentin genomin edellä mainittujen kromosomien yhden tai molempien homologien eliminaatio, eli molempien vanhempien kromosomit segregoituivat molemminpuolisesti - hyvin epätavallinen ilmiö, koska vain toisen vanhemman kromosomien segregaatio on ominaista sytohybrideille.

Lisäksi 20. viljelykerran jälkeen kaikissa hybridisolujen klooneissa oli vain somaattisen kumppanin X-kromosomin markkereita, ts. somaattisen kumppanin X-kromosomi oli korvautunut klooneissa ESC:n X-kromosomilla. Tämän tärkeän tosiasian vahvistavat in situ -hybridisaatiotiedot, joissa käytettiin hiiren X-kromosomille spesifistä FITC-leimattua koetinta: positiivinen signaali havaittiin vain yhdessä kromosomissa. On huomattava, että viljelyn aiemmissa vaiheissa (ennen 15. viljelykertaa) sytogeneettisten tietojen mukaan monissa soluissa oli kaksi X-kromosomia. Siksi selektiivisten elatusaineiden käyttö mahdollistaa hybridisolujen kromosomikoostumuksen manipuloinnin ja somaattisen kumppanin yksittäisiä kromosomeja kantavien kloonien selektiivisen valinnan ESC-genomin taustaa vasten.

Koska sytohybridigenomin ainutlaatuinen piirre on vanhempien genomien lokalisoituminen samaan tumaan, herää luonnollisesti kysymys alkion genomin pluripotenttien ominaisuuksien säilymisestä alkion kantasolujen ja somaattisten solujen hybrideissä olosuhteissa, joissa se on läheisessä kosketuksessa erilaistuneen solun genomin kanssa. Morfologisesti alkion kantasolujen ja somaattisten solujen sytohybridit olivat samanlaisia kuin vanhempien alkion kantasolulinja. Pluripotenssin arviointi osoitti, että kaikki lähes diploidisen kromosomiston omaavat kloonit kykenivät muodostamaan alkiokappaleita suspensioviljelmissä, joissa oli läsnä kolmen alkiokerroksen johdannaisia.

Useimmat hybridisolut sisälsivät ECMA-7-antigeenin, varhaisille hiirialkioille ominaisen markkerin, ja niillä oli myös korkea alkalisen fosfataasin aktiivisuus. Vakuuttavimmat tiedot hybridisolujen korkeista pluripotenteista ominaisuuksista saatiin kokeissa, joissa saatiin sarja injektiokimeeroja, joihin osallistui HESS2-kloonin hybridisoluja. Biokemiallisten markkereiden analyysi osoitti, että luovuttajahybridisolujen jälkeläisiä oli läsnä useimmissa kimeerien kudoksissa. Siksi ESC-solujen ja somaattisten erilaistuneiden solujen fuusioimalla saadut hybridisolut säilyttävät pluripotenssin korkealla tasolla, mukaan lukien kyvyn muodostaa kimeeroja, kun niitä injektoidaan blastokystan onteloon.

Kloonit HESS2 ja HESS4 erosivat merkittävästi vanhempien kromosomien koostumuksen suhteen, mutta niillä oli samankaltaisia pluripotentteja ominaisuuksia. Voitaisiin olettaa, että pluripotenssi hybridigenomissa ilmenee dominoivana ominaisuutena, mutta on mahdollista, että kaikki alkion genomin kromosomit eivät ole mukana pluripotenssin ylläpitämisprosessissa. Jos tämä oletus on oikea, voidaan odottaa, että joidenkin pluripotentin kumppanin kromosomien poistuminen hybridisolujen genomista ei johda muutokseen niiden pluripotenttisessa tilassa. Tässä tapauksessa vanhempien kromosomien segregaation analysointi alkion hybridisoluissa antaisi meille mahdollisuuden lähestyä lähemmin alkion solujen pluripotenssin säätelystä vastaavien kromosomien tunnistamista.

O. Serov ym. (2001) eivät löytäneet jälkeläisiä 50 jälkeläisen joukosta, jotka saatiin risteyttämällä kimeerien genotyyppiä normaaleilla hiirillä, joilla oli 129/01a ja DD-hiirten X-kromosomi. Kirjoittajat uskovat, että tämä johtuu pluripotenssin vähenemisestä hybridisoluissa somaattisen genomin vaikutuksesta. Vaihtoehtoinen selitys voi olla trisomian negatiivinen vaikutus joihinkin autosomeihin ja sukupuolikromosomien epätasapaino (XXY-kromosomeja havaittiin soluissa 15. jaksottamiseen asti) hybridisoluissa meioosin aikana. On tunnettua, että XXY-solut eivät pysty läpikäymään meioosia ja muodostamaan sukusoluja. Trisomia voi myös aiheuttaa hybridisolujen proliferatiivisen aktiivisuuden vähenemistä, minkä seurauksena kimeerien kehityksen selektiivinen etu voi kuulua vastaanottaja-alkion soluille. Tästä seuraa, että hybridisolujen pluripotentin potentiaalin riittäväksi arvioimiseksi on välttämätöntä saada hybridiklooneja, joilla on normaali diploidinen kromosomijoukko.

O. Serovin ja yhteistyökumppaneiden (2001) kokeissa osoitettiin ensimmäistä kertaa mahdollisuus somaattisen solun X-kromosomin uudelleenohjelmointiin hybridisolujen genomissa. Kirjoittajien tämä johtopäätös perustuu hprt-geenin (X-kromosomimarkkeri) ilmentymisen analyysiin kimeerissä: DD/c-hiirten hprt-geenin alleelivariantin läsnäolo havaittiin kaikissa analysoiduissa kimeerisissä kudoksissa. On syytä korostaa, että hybridisolujen lisäämisen jälkeen blastokystan onteloon sytohybridit joutuvat ei-selektiivisiin olosuhteisiin ja X-kromosomin säilyminen hybridisolujen genomissa tarkoittaa, että siitä on tullut sen obligaattikomponentti, eikä genomi erota sitä pluripotentin kumppanin Y-kromosomista.

Yhteenvetona somaattisten ja pluripotenttien genomien vuorovaikutuksen analyysin tuloksista hybridialkion soluissa kirjoittajat päättelevät, että joissakin sytohybrideissä pluripotenssi ilmenee dominoivana ominaisuutena. Hybridigenomi kykenee uudelleenohjelmoimaan erilaistuneiden solujen yksittäisiä kromosomeja, mikä ei kuitenkaan sulje pois somaattisen genomin käänteisen vaikutuksen mahdollisuutta alkion genomin pluripotenssiin. Hybridisoluja viljeltäessä erilaistumisen induktio tapahtuu huomattavasti useammin kuin alkuperäisessä ESC-solulinjassa HM-1. Samanlainen vaikutus havaitaan primaaripesäkkeiden muodostumisen aikana: monet alkion hybridisolujen primaaripesäkkeet erilaistuvat muodostumisen alkuvaiheessa, ja kloonien menetykset ovat suuria niiden valinnan ja lisääntymisen aikana.

Siten alkion kantasolujen ja somaattisten solujen fuusiosta syntyvät sytohybridit säilyttävät pluripotenssin alkion genomin ainutlaatuisena ominaisuutena, vaikka ne ovatkin läheisessä kontaktissa erilaistuneiden solujen genomiin. Lisäksi tällaisissa hybridisoluissa on mahdollista ohjelmoida uudelleen erilaistuneista soluista peräisin olevia yksittäisiä kromosomeja. On edelleen epäselvää, missä määrin alkion genomin pluripotentit ominaisuudet säilyvät hybridisoluissa, erityisesti niiden kyky osallistua sukusolujen muodostumiseen kimeerissä. Tämä edellyttää normaalin karyotyypin omaavien alkion hybridisolujen hankkimista. Joka tapauksessa pluripotenteista alkion hybridisoluista voi tulla todellinen geneettinen malli pluripotenssin ylläpitämiseen tai sen kontrollointiin osallistuvien kromosomien tunnistamiseksi, koska vanhempien kromosomien kahdenvälinen segregaatio tarjoaa mahdollisesti tällaisen mahdollisuuden.

Yhtä lailla houkuttelevaa on tutkia ilmiötä, jonka O. Serov ym. (2001) määrittelevät "kromosomimuistiksi". Hybridigenomissa homologiset kromosomit ovat kahdessa vaihtoehtoisessa konfiguraatiossa: somaattisen kumppanin homologit ovat kerran erilaistuneet, kun taas pluripotentin kumppanin homologeilla tämä prosessi on vasta alussa. Näin ollen hybridisolujen korkeiden pluripotenttien ominaisuuksien säilyminen osoittaa, että ESC-homologien "pluripotentti" konfiguraatio on riittävän stabiili hybridigenomissa somaattisesta kumppanista lähtöisin olevien transaktiotekijöiden vaikutuksesta huolimatta. Edellä kuvatut merkit erilaistuneen genomin homologisten kromosomien uudelleenohjelmoinnista kimeerien kehityksen aikana eivät sulje pois sitä mahdollisuutta, että sytohybridien muodostumisen ja viljelyn alkuvaiheissa in vitro ne säilyttävät in vivo -erilaistumisen aikana saavuttamansa statuksen. Äskettäin saatujen tietojen mukaan, kun alkion hybridisolut siirretään ei-selektiiviseen ympäristöön, ne osoittavat vain somaattisen kumppanin kromosomien intensiivistä eliminaatiota, ts. hybridisolujen genomi erottaa helposti homologit 10-15 jakson in vitro -viljelyn jälkeen. Siten alkion hybridisolut edustavat lupaavaa kokeellista mallia paitsi alkion genomin sellaisen perustavanlaatuisen ominaisuuden kuin pluripotenssin, myös sen vaihtoehdon - alkion erilaistumisen - tutkimiseksi.

Alkion kantasolusiirron terapeuttinen teho

Ennen kuin analysoimme alkion kantasolujen ja niiden johdannaisten siirron terapeuttista tehoa, tiivistämme edellä mainitun materiaalin. Alkiokantasolujen kyvyt alkionkehityksen täydelliseen toteuttamiseen in vitro ovat riittämättömät, koska kehityshäiriöt johtuvat tässä tapauksessa mesenkymaalisten kantasolujen puutteesta, jotka syntyvät kehossa itsenäisesti ja riippumatta alkion kantasoluista. Alkiokantasolujen geneettinen potentiaali on pienempi kuin tsygootin geneettinen potentiaali, joten alkion kantasoluja ei käytetä suoraan alkioiden kloonaamiseen. Alkiokantasolujen ainutlaatuista biologista potentiaalia ainoina soluina, joissa kehitysohjelmia käytetään täysimääräisesti ja johdonmukaisesti, hyödynnetään geenitoiminnan tutkimuksissa. Alkiokantasolujen avulla dekoodataan ensimmäiset signaaliyhdistelmät, jotka aktivoivat kolmen alkiokerroksen kehitystä koodaavien varhaisten ja myöhäisten geenien ilmentymistä. Alkiokantasolujen genomin pluripotenssin säilyminen in vitro tekee niistä ainutlaatuisen työkalun korjaavaan regeneraatioon, joka kykenee automaattisesti korvaamaan soluhäviöitä elinten ja kudosten vaurioituessa. Ideaalisessa hypoteettisessa skenaariossa voidaan olettaa, että "... luovuttajan alkion kantasoluja siirrettäessä vastaanottajan kehoon siirtyy kompaktisti pakattuja ohjelmia, jotka suotuisissa olosuhteissa toteutuvat uuden kudoksen rakentamisessa"7, joka kykenee "... integroitumaan tehokkaasti vastaanottajan kehoon sekä morfologisella että toiminnallisella tasolla".

Luonnollisesti, alkion kantasolujen monodifferentiaatiomenetelmien kehittymisen jälkeen, aloitettiin in vitro -tutkimuksia yhdestä erikoistuneesta kloonista saatujen solujen toiminnallisesta aktiivisuudesta in vivo. Lisääntyvä alkion kantasoluklooni tuottaa migraatiosolujen populaatioita, jotka todella kykenevät integroitumaan aktiivisesti vastaanottajakudoksen vaurioalueille, mitä käytetään regeneratiivisessa plastisessa lääketieteessä. On osoitettu, että DOPA-neuronien siirto mustatumakkeeseen vähentää kliinisiä ilmenemismuotoja kokeellisessa hemiparkinsonismissa. Luovuttajahermosolujen alueelliset siirrot vähentävät selkäytimen ja aivojen trauman tai ruhjeen aiheuttamien liikehäiriöiden astetta. Myös kantasolusiirroista on saatu ensimmäisiä positiivisia tuloksia demyelinisoivissa sairauksissa. Näyttää siltä, että alkion kantasolujen regeneratiivis-plastinen potentiaali avaa rajattomat mahdollisuudet solusiirron käytölle käytännön lääketieteessä. Kuitenkin, kun ne siirretään ektooppisille alueille, alkion kantasolut muuttuvat väistämättä kasvaimiksi. Teratoomia muodostuu, kun alkion kantasoluja injektoidaan ihon alle immuunipuutteisille hiirille. Kun ESC-suspensioita siirretään syngeenisten hiirten kiveksen kapselin alle, muodostuu myös teratoomia, jotka koostuvat erilaisista kudoksista, joiden solut ovat peräisin kaikista kolmesta alkiokerroksesta. Tällaisissa teratomoissa vähentyneen organogeneesin prosessit ovat erittäin harvinaisia.

Useat tutkimukset antavat tietoa varhaisten alkion kantasolujohdannaisten siirtämisen positiivisista tuloksista kokeellisesti patologisille eläimille. Solujen neurotransplantaatiota alkion kantasolujohdannaisilla kehitetään edelleen kokeissa ja ensimmäisissä kliinisissä tutkimuksissa aivo- ja selkäydinvammojen toiminnallisten häiriöiden korjaamiseksi sekä syringomyelian ja multippeliskleroosin hoitamiseksi (Repin, 2001). Alkion aivokudoksen sijaan alkion kantasoluista saatujen neurosfäärijohdannaisten siirtämiseen kehitetään menetelmiä. Tällaiset siirrännäissuspensiot ovat huomattavasti homogeenisempia ja sisältävät sitoutuneita hermosolujen ja neuroglian esiasteita.

Kun retinoiinihappoa lisätään säännöllisesti annoksella 10 μg/ml viljelyalustaan 6 viikon ajan, yli 80 % postmitoottisista neuroneista muodostuu ihmisen alkion-(terato)karsinoomasolulinjassa NTERA-2. Neuronipopulaation täydellinen homogeenisuus saavutetaan immunofenotyyppisillä markkereilla merkittyjen kypsien neuronien virtauslajittelulla, mikä mahdollistaa teratokarsinooman ja epäkypsien solujen jäänteiden poistamisen. Koe-eläinten aivojen eri alueille siirron jälkeen tällaiset neuronit eivät ainoastaan selviä, vaan myös integroituvat alueellisiin hermoverkkoihin. Eläimillä, joilla on kokeellisia paikallisten keskushermostovaurioiden malleja, neurotransplantaatio vähentää sellaisten ihmisen patologioiden kliinisiä ilmenemismuotoja kuin traumaattisen aivovamman, aivohalvauksen, myeliinin vaurioitumista aiheuttavien sairauksien, perinnöllisten pikkuaivojen kehityshäiriöiden sekä lipidi- ja polysakkaridikertymäsairauksien seuraukset.

Keskushermoston degeneratiivisten sairauksien regeneraatioprosessien optimoimiseksi kehitetään teknologioita myeliiniä tuottavien oligodendrosyyttien saamiseksi alkion kantasoluista (ESC). Ensimmäiseen vaiheeseen kuuluu perinteisesti ESC-solujen lisääntyminen ja siirtoon tarvittavan solumäärän lisääntyminen. Toisessa vaiheessa suoritetaan solujen kohdennettu erilaistuminen myeliiniä tuottavien oligodendrosyyttien esiasteiden populaatioksi, jota kontrolloidaan selektiivisillä markkeriantigeeneillä.

Tiettyjä mahdollisuuksia on avautumassa ESC-johdannaisten käytölle sellaisten menetelmien kehittämisessä, joilla korjataan kateenkorvan kypsymisen geneettisten vikojen aiheuttamia immuunipuutoksia. Tutkimuksissa, joissa käytettiin poistogeenisillä (rag 1) hiirillä, joilla oli indusoitu geenivika – TCR-geenien V(D)J-lokusten rekombinaatiomekanismin häiriö, joka johti T-lymfosyyttien toiminnan menetykseen – varhaisten ESC-johdannaisten siirto eläinten kateenkorvaan palauttaa soluimmuniteetista vastaavien immuunikloonien normaalien populaatioiden kypsymisen. Kliiniset tutkimukset in vitro -esimuotoisten ESC-solujen siirrosta lasten kuolemaan johtavien perinnöllisten anemioiden hoitoon ovat käynnissä.

Kantasolusiirtojen nopeaa käyttöönottoa kliinisessä järjestelmässä vastustetaan rajoitetusti pysyvien ihmisalkion kantasolulinjojen määrällä ja niiden standardoinnin tarpeella. Standardoitujen alkion kantasolulinjojen, samoin kuin aikuisten ihmisen kantasolujen, puhtauden lisäämiseksi ehdotetaan käytettäväksi linjavalintamenetelmää, joka perustuu lyhyiden tandem-DNA-toistojen molekyyligeneettiseen analyysiin. On myös tarpeen testata alkion kantasolulinjoja pienten kromosomien uudelleenjärjestelyjen ja geneettisten mutaatioiden varalta, joiden esiintymispotentiaali soluviljelyolosuhteissa on melko suuri. Esitetään teesi kaikenlaisten alkion kantasolujen ja alueellisten pluripotenttien kantasolujen ominaisuuksien pakollisesta testaamisesta, koska niiden lisääntyminen in vitro voi johtaa uusien ominaisuuksien syntymiseen, jotka eivät ole luontaisia alkion kantasoluille tai definitiivisille kudoksille. Erityisesti oletetaan, että pitkäaikainen viljely sytokiineja sisältävässä elatusaineessa tuo alkion kantasolulinjoja lähemmäksi kasvainsoluja, koska ne käyvät läpi samanlaisia muutoksia solusyklin säätelyreiteissä, kun ne saavat kyvyn suorittaa rajattoman määrän solunjakaumia. Jotkut kirjoittajat pitävät varhaisten alkion kantasolujohdannaisten siirtoa ihmisiin holtittomana kasvainten kehittymispotentiaalin perusteella. Heidän mielestään on paljon turvallisempaa käyttää ESC-solujen sitoutuneita jälkeläisiä eli erilaistuneiden solujen kantasolujen linjoja. Tällä hetkellä ei kuitenkaan ole vielä kehitetty luotettavaa tekniikkaa stabiilien, haluttuun suuntaan erilaistuvien ihmissolulinjojen saamiseksi.

Kirjallisuudessa ilmestyy siis yhä enemmän tietoa ihmisalkion kantasolujohdannaisten siirron positiivisesta terapeuttisesta vaikutuksesta. Monia näistä tutkimuksista kuitenkin tarkastellaan ja kritisoidaan. Jotkut tutkijat uskovat, että varhaisten kliinisten tutkimusten tulokset ovat luonteeltaan alustavia ja osoittavat vain, että kantasolut kykenevät vaikuttamaan suotuisasti tietyn sairauden kliiniseen kulkuun. Siksi on tarpeen saada tietoa solusiirtojen kaukaisista tuloksista. Argumenttina mainitaan kliinisen neurotransplantologian kehitysvaiheet. Aluksi kirjallisuudessa vallitsivat julkaisut alkion aivopalojen siirron korkeasta tehokkuudesta Parkinsonin taudissa, mutta sitten alkoi ilmestyä raportteja, joissa kiistettiin potilaiden aivoihin siirretyn alkion tai sikiön hermokudoksen terapeuttinen tehokkuus.

Ensimmäiset kliiniset tutkimukset tehtiin NTERA-2-teratoksinoomasoluista (ESC) peräisin olevien neuroblastien siirron turvallisuuden arvioimiseksi. Näiden epäkypsiä soluja proliferoitiin viljelmässä, kunnes niitä kertyi 100 miljoonaa solumassaa. Joitakin tällä tavoin saatuja soluja käytettiin fenotyypin karakterisointiin ja soluepäpuhtauksien määrittämiseen sekä mahdollisen virus- ja bakteerikontaminaation testaamiseen. LIF ja sikiön stroomasolujen syöttökerros poistettiin viljelyalustasta, ja luotiin olosuhteet ESC-solujen kohdennetulle erilaistumiselle neuroblasteiksi käyttämällä sytokiinien ja kasvutekijöiden yhdistelmää. Sitten neuroblastit puhdistettiin epäkypsistä teratoksinoomasoluista virtaussolulajittelijalla. Siirrettyjen solujen toissijaisen puhdistuksen ja fenotyyppikarakterisoinnin jälkeen neuroblastisuspensio (10–12 miljoonaa) injektoitiin potilaiden aivojen tyvitumakkeeseen (seitsemäntenä kuukautena verenvuotohalvauksen jälkeen) käyttämällä erityistä mikrokanyyliä ja ruiskua stereotaksisen ja tietokonetomografian valvonnassa. Elinsiirron jälkeinen vuoden aikainen seulonta hermosolusiirron seurauksista aivohalvausalueelle ei paljastanut sivuvaikutuksia tai ei-toivottuja vaikutuksia. Puolet potilaista osoitti motoristen toimintojen paranemista 6–12 kuukauden kuluessa elinsiirrosta. Positiivisiin kliinisiin muutoksiin liittyi lisääntynyt verenkierto aivohalvausalueella solusiirron jälkeen: fluoresoivasti leimatun 2-deoksiglukoosin imeytymisen keskimääräinen kasvu positroniemissiotomografian mukaan oli 18 % ja joillakin potilailla jopa 35 %.

Yhdysvaltain kansalliset terveysinstituutit (National Institutes of Health) tekivät kuitenkin riippumattoman tutkimuksen neurotransplantaation kliinisestä tehokkuudesta Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla. Ensimmäisen ryhmän potilaille siirrettiin dopamiinia tuottavia alkion hermokudoksen osia, kun taas toiselle potilasryhmälle tehtiin lumeleikkaus. Tulokset osoittavat, että tällaisella neurotransplantaation kliininen tehokkuus oli nolla, vaikka dopamiinia tuottavat alkion hermosolut säilyivät vastaanottajien aivoissa. Lisäksi kaksi vuotta alkion hermokudoksen siirron jälkeen 15 %:lle potilaista kehittyi pysyvä dyskinesia, jota ei ollut lumelääkeryhmässä (Stem cells: scientific progress and future research directions. Nat. Inst, of Health. USA). Näiden potilaiden taudin kehittymisen havainnointi on edelleen käynnissä.

Jotkut kirjoittajat yhdistävät ristiriitaiset kirjallisuustiedot neurotransplantaation kliinisen tehokkuuden arvioinnista erilaisiin lähestymistapoihin potilasryhmien valinnassa, riittämättömiin menetelmien valintaan heidän tilan objektiiviseksi arvioimiseksi ja ennen kaikkea alkion hermokudoksen ja aivojen eri alueiden, joista tämä kudos on saatu, erilaisiin siirtokokoihin ja kirurgisen toimenpiteen metodologisiin ominaisuuksiin.

On huomattava, että yritykset siirtää pluripotentteja alkion kantasoluja suoraan kokeellista hemiparkinsonismia sairastavien rottien aivojen striatum-alueelle ovat johtaneet alkion kantasolujen lisääntymiseen ja niiden erilaistumiseen dopaminergisiksi neuroneiksi. On oletettava, että vasta muodostuneet neuronit integroituivat tehokkaasti hermoverkkoihin, koska alkion kantasolujen siirron jälkeen havaittiin käyttäytymispoikkeavuuksien ja motorisen epäsymmetrian korjaantumista apomorfiinitestissä. Samaan aikaan jotkut eläimet kuolivat siirrettyjen alkion kantasolujen muuttuessa aivokasvaimiksi.

Yhdysvaltain kansallisen ja lääketieteellisen akatemian asiantuntijat sekä Yhdysvaltain kansallisen terveysinstituutin (NIH) asiantuntijat uskovat, että alkion kantasolujen kliininen potentiaali ansaitsee vakavinta huomiota, mutta korostavat tarvetta tutkia yksityiskohtaisesti niiden ominaisuuksia, komplikaatioiden todennäköisyyttä ja pitkäaikaisia seurauksia kokeissa, joissa käytetään riittäviä biologisia malleja ihmissairauksille (Stem cells and the future regenerative medicine National Academy Press.; Stem cells and the future research directions. Nat. Inst, of Health USA).

Tästä näkökulmasta on tärkeää, että kokeellisten teratoomien vertaileva histologinen analyysi, joka tehtiin siirtämällä alkion kantasolususpensiota kivekseen, ja varhaisen alkion kantasoluja sisältävän alkion kantasolun siirron seurauksena muodostuneiden teratoomien välillä, osoitti, että alkion kantasolut, alkuperästään tai vuorovaikutuksestaan tiettyjen ympäröivien solujen kanssa, toteuttavat kasvaimia aiheuttavan potentiaalinsa samalla tavalla. On osoitettu, että tällaisilla teratomoilla on klonaalinen alkuperä, koska kasvaimet, jotka koostuvat kaikkien kolmen itusolukerroksen johdannaisista, voivat syntyä yhdestä alkion kantasolusta (Rega, 2001). On huomionarvoista, että kun kloonattuja alkion kantasoluja, joilla oli normaali karyotyyppi, siirrettiin immuunipuutteisiin hiiriin, muodostui myös teratoomeja, jotka koostuivat erityyppisistä erilaistuneista somaattisista soluista. Nämä kokeelliset tiedot ovat kiistaton todiste teratoomien klonaalisesta alkuperästä. Kehitysbiologian näkökulmasta ne osoittavat, että teratooman muodostavien kaikkien kolmen itusolukerroksen erilaistuneiden johdannaisten lähteenä ei toimi useat sitoutuneet progenitorisolut, vaan yksi pluripotentti kantasolu. Käytännön solusiirtojen tiellä näiden tutkimusten tulokset ovat kuitenkin, ellei jopa kielteinen, niin varoitusmerkki mahdollisesta vaarasta, sillä alkion kantasolujen tai alkusukusolujen rokottaminen aikuisten immuunipuutteisten hiirten eri kudoksiin aiheuttaa väistämättä kasvainten kehittymistä siirretyistä kantasoluista. Ektooppisesti siirrettyjen alkion kantasolujen neoplastiseen rappeutumiseen liittyy erilaistuneiden solujen satelliittipopulaatioiden syntyminen - johtuen alkion kantasolujen ja progenitorikloonien osittaisesta erilaistumisesta erikoistuneiksi soluiksi. On mielenkiintoista, että kun alkion kantasoluja siirretään luurankolihaksiin, neuroneja muodostuu useimmiten teratokarsinoomasolujen viereen. Alkiosolujen lisääminen jakautuvaan munasoluun tai blastokystaan liittyy kuitenkin solujen täydelliseen integroitumiseen alkioon ilman neoplastisten elementtien muodostumista. Tässä tapauksessa alkion kantasolut integroituvat käytännössä kaikkiin alkion elimiin ja kudoksiin, mukaan lukien sukupuolielinten alkusolut. Tällaisia allofeenieläimiä saatiin ensimmäisen kerran lisäämällä teratokarsinooma 129 -soluja varhaisiin alkioihin 8-100 soluvaiheessa. Allofeenihiirissä luovuttajasolukantasoluista peräisin olevat heterogeeniset solupopulaatiot integroituvat luuytimen, suoliston, ihon, maksan ja sukupuolielinten kudoksiin, mikä mahdollistaa jopa lajien välisten solukimeerojen luomisen kokeessa. Mitä lyhyempi varhaisen alkion kehitysaika on, sitä suurempi on solujen kimerisaatioprosentti, ja korkein kimerisaatioaste havaitaan allofeenialkion hematopoieettisessa järjestelmässä, ihossa, hermostossa, maksassa ja ohutsuolessa. Aikuisen organismin histohematopoieettisten esteiden suojaamat kudokset ovat alttiita kimerisaatiolle:Primaaristen sukusolujen siirto kiveksen parenkyymiin liittyy luovuttajan kantasolujen liittymiseen vastaanottajan alkiokudokseen. Kuitenkin, kun ESC:itä siirretään blastokystaan, sukupuolielinten kimeeristen alkioiden muodostumista luovuttajan primaaristen sukusolujen muodostumisen yhteydessä ei tapahdu. ESC:iden pluripotenssia, kun luodaan erityisolosuhteet, voidaan käyttää myös kloonaukseen: hiiren ESC:iden siirtäminen 8-16-soluiseen hiiren alkioon, jossa sytokalsiini estää solumitoosit, edistää normaalin alkionkehityksen toteutumista alkion kehittyessä luovuttajan ESC:istä.

Siksi vaihtoehto allogeeniselle alkion kantasolujen siirrolle on terapeuttinen kloonaus, joka perustuu somaattisten solujen tumien siirtoon munasoluun, jolloin luodaan blastokysti, jonka sisäisestä solumassasta eristetään somaattisen tuman luovuttajan kanssa geneettisesti identtisiä alkion kantasolulinjoja. Teknisesti tämä ajatus on varsin toteuttamiskelpoinen, koska mahdollisuus luoda alkion kantasolulinjoja blastokystoista, jotka on saatu somaattisten tumien siirron jälkeen munasoluihin, on toistuvasti osoitettu laboratorioeläimillä tehdyissä kokeissa (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Erityisesti rag2-geenimutaation suhteen homotsygoottisissa hiirissä käytettiin epidermaalisten kudossolujen viljelystä saatuja fibroblasteja tumien luovuttajina, jotka siirrettiin enukleoituihin munasoluihin. Munasolujen aktivoinnin jälkeen "tsygoottia" viljeltiin blastokystan muodostumiseen asti, jonka sisäisestä solumassasta eristettiin alkion kantasolut ja siirrettiin mutanttigeenille (rag2~/~) nullitsygoottiseen solulinjaan. Yhden alleeligeenin mutaatio korjattiin tällaisissa alkion kantasoluissa homologisen rekombinaation menetelmällä. Ensimmäisessä koesarjassa alkionrunkoja saatiin alkion kantasoluista, joissa oli rekombinantti palautettu geeni, niiden solut transfektoitiin rekombinantti retroviruksella (HoxB4i/GFP) ja lisääntymisen jälkeen injektoitiin rag2~/~-hiirten laskimoon. Toisessa sarjassa tetraploidiset blastomeerit aggregoitiin geneettisesti muunneltujen alkion kantasolujen kanssa ja siirrettiin vastaanottajanaaraisiin. Tuloksena olevat immunokompetentit hiiret toimivat luuytimen luovuttajina rag2~/~-mutanttihiirten siirtoa varten. Molemmissa sarjoissa tulos oli positiivinen: 3-4 viikon kuluttua kaikista hiiristä löydettiin kypsiä normaaleja myeloidi- ja lymfoidisoluja, jotka kykenivät tuottamaan immunoglobuliineja. Siten somaattisten solujen tumien siirtoa munasoluihin voidaan käyttää paitsi alkion kantasolulinjojen saamiseksi, myös sytogenoterapiaan - perinnöllisten poikkeavuuksien korjaamiseen käyttämällä alkion kantasoluja vektorina korjaavan geneettisen tiedon kuljettamiseen. Mutta tällä solunsiirron suunnalla on bioeettisten ongelmien lisäksi rajoituksensa. On epäselvää, kuinka turvallista terapeuttisesti kloonattujen solujen, joiden genotyyppi on identtinen tietyn potilaan genotyypin kanssa, siirto on, koska tällaiset solut voivat aiheuttaa mutaatioita, jotka luovat alttiuden muille sairauksille. Normaaleihin ihmisen munasoluihin on edelleen vaikea päästä käsiksi, kun taas jopa somaattisten tumakkeiden siirtämisestä eläinten munasoluihin, joihin on poistettu tuma, vain 15–25 % rakennetuista "tsygooteista" kehittyy blastokystin vaiheeseen. Ei ole vielä määritetty, kuinka monta blastokystaa tarvitaan yhden pluripotenttien kloonattujen alkion kantasolujen linjan saamiseksi. On myös syytä huomata terapeuttisen kloonausmenetelmän monimutkaisuuteen liittyvät korkeat taloudelliset kustannukset.

Yhteenvetona on todettava, että alkion kantasoluissa (ESC) hypometyloidun DNA:n omaavan genomin pluripotenssi yhdistyy korkeaan telomeraasiaktiivisuuteen ja lyhyeen solusyklin C^-vaiheeseen, mikä varmistaa niiden intensiivisen ja mahdollisesti loputtoman lisääntymisen, jonka aikana ESC:t säilyttävät diploidisen kromosomijoukon ja "juveniilin" fenotyyppisten ominaisuuksien joukon. ESC:iden klonaalinen kasvu viljelmässä ei häiritse niiden erilaistumista millekään organismin erikoistuneeksi solulinjaksi, kun lisääntyminen pysäytetään ja lisätään asianmukaiset säätelysignaalit. ESC:iden restriktioerottelu somaattisiin solulinjoihin in vitro toteutuu ilman mesenkyymin osallistumista, ohittaen Nochteys-solut, organogeneesin ulkopuolella ja ilman alkion muodostumista. ESC:iden ektoopinen lisääminen in vivo johtaa väistämättä teratokarsinoomien muodostumiseen. ESC:iden siirto blastokystaan tai varhaiseen alkioon liittyy niiden integroitumiseen alkion kudoksiin ja sen elinten vakaaseen kimerisaatioon.

Solujen siirtoon perustuvat regeneratiivis-plastiset teknologiat ovat solubiologian, kehitysbiologian, kokeellisen genetiikan, immunologian, neurologian, kardiologian, hematologian ja monien muiden kokeellisen ja käytännön lääketieteen alojen edustajien intressien yhtymäkohta. Kokeellisten tutkimusten tärkeimmät tulokset osoittavat kantasolujen uudelleenohjelmoinnin mahdollisuuden niiden ominaisuuksien kohdennetulla muutoksella, mikä avaa mahdollisuuksia sytodifferentiaatioprosessien kontrolloimiseen kasvutekijöiden avulla - sydänlihaksen uudistamiseen, keskushermostovaurioiden palauttamiseen ja haiman saarekejärjestelmän toiminnan normalisointiin. Jotta kantasolujen johdannaisten siirto voitaisiin ottaa laajalti käyttöön käytännön lääketieteessä, on kuitenkin tarpeen tutkia ihmisen kantasolujen ominaisuuksia yksityiskohtaisemmin ja jatkaa kokeita kantasoluilla kokeellisissa sairausmalleissa.

Bioeettiset kysymykset ja allogeenisen solusiirteen hyljintäongelma voitaisiin ratkaista aikuisen organismin alueellisten kantasolujen genomin löydetyllä plastisuudella. Alkuperäistä tietoa, jonka mukaan eristettyjen ja huolellisesti karakterisoitujen hematopoieettisten autologisten solujen siirtäminen maksaan, josta uudet maksasolut ovat peräisin, integroituu maksalohkoihin, tarkistetaan ja kritisoidaan nyt. Siitä huolimatta on julkaistu tietoja, joiden mukaan hermostollisten kantasolujen siirto kateenkorvaan aiheuttaa uusien luovuttaja-T- ja B-lymfosyyttien itujen muodostumista, ja aivojen hermostollisten kantasolujen siirto luuytimeen johtaa hematopoieettisten itujen muodostumiseen, joilla on pitkäaikainen luovuttajamyelo- ja erytropoieesi. Näin ollen pluripotentit kantasolut, jotka kykenevät ohjelmoimaan genomin uudelleen ESC-potentiaalin mukaisiksi, voivat säilyä aikuisen organismin elimissä.

Lääketieteellisiin tarkoituksiin käytettävien alkion kantasolujen (ESC) lähteenä on edelleen ihmisalkio, mikä määrää väistämättömästi uuden moraalisten, eettisten, oikeudellisten ja uskonnollisten kysymysten yhtymäkohdan ihmiselämän synnyssä. ESC:n löytäminen on antanut voimakkaan sysäyksen kiivaan keskusteluun elävien solujen ja aineen, olennon ja persoonallisuuden välisestä rajasta. Samaan aikaan ei ole olemassa yleismaailmallisia normeja, sääntöjä tai lakeja ESC:n käytöstä lääketieteessä, vaikka niitä on toistuvista yrityksistä huolimatta luotu ja otettu käyttöön. Jokainen valtio ratkaisee tämän ongelman itsenäisesti lainsäädäntönsä puitteissa. Lääkärit ympäri maailmaa pyrkivät puolestaan viemään regeneratiivisen plastisen lääketieteen tällaisten keskustelujen ulkopuolelle, pääasiassa käyttämällä aikuisten kantasoluvarantoja alkion kantasolujen sijaan.

Hieman alkion kantasolujen eristämisen historiaa

Terato(alkio)karsinoomasoluja eristettiin 129/ter-Sv-hiirten spontaanisti syntyneistä kivesten teratoomeista, Lt/Sv-hiirten spontaanisti syntyneistä munasarjojen teratoomeista ja ektooppisesti siirretyistä alkion soluista tai kudoksista peräisin olevista teratoomeista. Tällä tavoin saaduista stabiileista hiiren terato(alkio)karsinoomasolulinjoista jotkut olivat pluripotentteja, toiset erilaistuivat vain yhdeksi tietyksi solutyypiksi ja jotkut olivat täysin kykenemättömiä soluerilaistumiseen.

Yhteen aikaan keskityttiin tutkimuksiin, joiden tulokset osoittivat mahdollisuuden palauttaa terato-(alkio)karsinoomasolut normaaliin fenotyyppiin niiden lisäämisen jälkeen kehittyvän alkion kudoksiin, sekä työhön geneettisesti muunneltujen terato-(alkio)karsinoomasolujen in vitro -luomiseksi, joiden avulla saatiin mutanttihiiriä ihmisen perinnöllisen patologian biologista mallintamista varten.

Ehdollista suspensioviljelyä käytettiin terato-(alkio)karsinoomasolulinjojen eristämiseen. Viljelmässä terato-(alkio)karsinoomasolut, kuten alkion kantasolut (ESC), kasvavat muodostaen alkiokappaleita ja vaativat pakollista dissosiaatiota solulinjan siirtoa varten, säilyttäen pluripotenssin alkion fibroblastien syöttökerroksessa tai suspensioviljelyn aikana ehdollisessa elatusaineessa. Pluripotenttien terato-(alkio)karsinoomalinjojen solut ovat suuria, pallomaisia, niille on ominaista korkea alkalisen fosfataasin aktiivisuus, ne muodostavat aggregaatteja ja kykenevät erilaistumaan monisuuntaisesti. Kun ne viedään blastokystaan, ne aggregoituvat morulan kanssa, mikä johtaa kimeeristen alkioiden muodostumiseen, jotka ovat osa eri elimiä ja kudoksia, joista löytyy terato-(alkio)karsinoomasolujen johdannaisia. Suurin osa tällaisista kimeerisistä alkioista kuitenkin kuolee kohdussa, ja eloonjääneiden vastasyntyneiden kimeerien elimissä vieraita soluja havaitaan harvoin ja niiden tiheys on alhainen. Samaan aikaan kasvainten (fibrosarkooma, rabdomyosarkooma, muut pahanlaatuiset kasvaimet ja haiman adenooma) esiintyvyys kasvaa jyrkästi, ja kasvaimen rappeutuminen tapahtuu usein kimeeristen alkioiden kohdunsisäisen kehityksen aikana.

Useimmat terato-(alkio)karsinoomasolut normaaleiden alkion solujen mikroympäristössä saavat lähes luonnostaan pahanlaatuisia neoplastisia ominaisuuksia. Uskotaan, että peruuttamaton pahanlaatuisuus johtuu proto-onkogeenien aktivoitumisesta rakenteellisten uudelleenjärjestelyjen prosessissa. Yksi poikkeus ovat hiiren kivesten teratoomista (linja 129/Sv-ter) saadut alkiokarsinoomasolulinjan SST3 solut, joilla on korkea kyky integroitua alkion kudoksiin ja elimiin ilman myöhempää kasvaimen muodostumista kimeerisissä hiirissä. Kimeeristen hiirten terato-(alkio)karsinoomasolulinjojen johdannaiset eivät käytännössä osallistu primaaristen gonosyyttien muodostumiseen. Ilmeisesti tämä johtuu useimmille terato-(alkio)karsinoomalinjoille tyypillisestä korkeasta kromosomipoikkeavuuksien esiintymistiheydestä, joiden soluissa havaitaan sekä aneuploidiaa että kromosomipoikkeavuuksia.

Laboratorio-olosuhteissa saatiin useita stabiileja ihmisen terato-(alkio)karsinoomasolulinjoja, joille oli ominaista pluripotenssi, korkea proliferatiivinen aktiivisuus ja kyky erilaistua viljelmissä kasvamisen aikana. Erityisesti ihmisen terato-(alkio)karsinoomasolulinjaa NTERA-2 käytettiin hermosolujen soludifferentiaation mekanismien tutkimiseen. Tämän linjan solujen siirron jälkeen vastasyntyneiden rottien etuaivojen subventrikulaariseen alueelle havaittiin niiden migraatiota ja neurogeneesiä. Terato-(alkio)karsinoomalinjan NTERA-2 solujen viljelystä saatuja neuroneja yritettiin jopa siirtää aivohalvauspotilaille, mikä kirjoittajien mukaan johti taudin kliinisen kulun paranemiseen. Samaan aikaan ei ollut tapauksia, joissa siirretyt terato-(alkio)karsinoomalinjan NTERA-2 solut olisivat muuttuneet pahanlaatuisiksi aivohalvauspotilailla.

Evans ja Martin eristivät ensimmäiset erilaistumattomat pluripotentit hiiren alkion kantasolulinjat 1980-luvun alussa blastokystan sisäisestä solumassasta – alkioblastista. Eristetyt alkion kantasolulinjat säilyttivät pluripotenssin ja kyvyn erilaistua erilaisiksi solutyypeiksi tiettyjen tekijöiden vaikutuksesta erityisessä viljelyalustassa pitkään.

Termi "alkion pluripotentit kantasolut" itsessään kuuluu Leroy Stevensille, joka tutkiessaan tupakkatervan vaikutusta kasvainten kehittymisen ilmaantuvuuteen kiinnitti huomiota kivesten teratokarsinooman spontaaniin esiintymiseen kontrolliryhmän lineaarisissa (129/v) hiirissä. Kivesten teratokarsinoomien soluille oli ominaista korkea lisääntymisnopeus, ja vatsaontelon nesteen läsnä ollessa ne erilaistuivat spontaanisti muodostaen neuroneja, keratinosyyttejä, kondrosyyttejä, kardiomyosyyttejä sekä hiuksia ja luupalasia, mutta ilman merkkejä vastaavan kudoksen järjestäytyneestä sytoarkkitehtuurista. Viljelmään sijoitettuna teratokarsinoomasolut kasvoivat pluripotentteina klooneina, jotka olivat irrallaan substraatista, ja muodostivat alkiorakenteita, minkä jälkeen ne lakkasivat jakautumasta ja erilaistuivat spontaanisti neuroneiksi, gliasoluiksi, lihassoluiksi ja kardiomyosyyteiksi. Stevens havaitsi, että hiiren teratokarsinooma 129/v sisältää alle 1 % soluja, jotka kykenevät erilaistumaan erilaisiksi erikoistuneiksi somaattisiksi soluiksi, ja itse erilaistuminen riippuu niihin vaikuttavista tekijöistä (vatsakalvonesteen koostumus, kypsien solujen tuotteet tai viljelmään lisätyt kudokset). Leroy Stevensonin hypoteesi sukusolujen alkion kantasolujen esiintymisestä teratokarsinoomasolujen joukossa vahvistettiin: preimplantaatioalkioista peräisin olevien alkioblastisolujen suspensio aikuisten hiirten kudoksissa muodosti teratokarsinoomia, ja niistä vatsaontelonsisäisen annon jälkeen vastaanottajaeläimille eristetyt puhtaat solulinjat erilaistuivat neuroneiksi, sydänlihassoluiksi ja muiksi somaattisiksi soluiksi, jotka olivat peräisin kaikista kolmesta alkiokerroksesta. In vivo -kokeissa alkion kantasolusolujen (jotka saatiin alkioblastista, mutta eivät trofoblastista) siirto toisen linjan hiirialkioihin blastomeerivaiheissa 8-32 johti kimeeristen eläinten syntymiseen (ilman kasvainten kehittymistä), joiden elimistä löydettiin luovuttajakudoksen ituja. Kimerismiä havaittiin jopa sukusolulinjassa.

Hiiren alkion sukupuolielinten rudimentista eristetyt primaariset progenitori-itusolut vastasivat morfologialtaan, immunologiselta fenotyypiltään ja toiminnallisilta ominaisuuksiltaan Stevensonin teratokarsinoomasta ja alkion blasteista saamia alkion kantasoluja. Kimeerien, jotka syntyivät sen jälkeen, kun alkion kantasolut oli lisätty blastokystaan, allofeenimorfogeneesille oli ominaista luovuttajan ja vastaanottajan maksan, keuhkojen ja munuaisten rakenteellisten ja toiminnallisten yksiköiden mosaiikkinen vuorottelu. Joissakin tapauksissa havaittiin suoliston kryptojen tai maksalohkojen muodostumista, jotka koostuivat sekä vastaanottaja- että luovuttajasoluista. Morfogeeni toteutui kuitenkin aina sen lajin geneettisen ohjelman mukaisesti, johon vastaanottaja kuului, ja kimerismi rajoittui yksinomaan solutasolle.

Tuolloin todettiin, että alkion kantasolujen lisääntyminen ilman sytodifferentiaatiota mesenkyymistä peräisin olevien solujen (sikiön fibroblastien) syöttökerroksessa tapahtuu LIF:n pakollisen läsnäolon avulla selektiivisissä ravintoalustoissa, jotka selektiivisesti varmistavat vain kantasolujen ja progenitorisolujen selviytymisen, kun taas valtaosa erikoistuneista soluelementeistä kuolee. Tällaisten menetelmien avulla James Thomson eristi vuonna 1998 viisi kuolemattomaksi tehtyä alkion kantasolulinjaa ihmisen blastokystan sisäisestä solumassasta. Samana vuonna John Gerhart kehitti menetelmän kuolemattomien alkion kantasolulinjojen eristämiseksi neljästä viiteen viikon ikäisten ihmisalkioiden sukupuolielinten tuberkuloosista. Ainutlaatuisten ominaisuuksiensa ansiosta vain kaksi vuotta myöhemmin alkion kantasoluja ja definitiivisten kudosten kantasoluja alettiin käyttää regeneratiivisen lääketieteen ja geeniterapian käytännössä.