Mesenkymaaliset kantasolut

Alueellisten kantasolujen joukossa erityistä paikkaa pitävät mesenkymaaliset kantasolut (MSC:t), joiden johdannaiset muodostavat kaikkien ihmiskehon elinten ja kudosten stroomatriisin. MSC-tutkimuksessa etusijalla ovat Venäjän biologian edustajat.

Viime vuosisadan puolivälissä A. Friedensteinin laboratoriossa eristettiin ensimmäistä kertaa homogeeninen viljelmä luuytimen multipotentteja stroomakantasoluja. Substraattiin kiinnittyneet mesenkymaaliset kantasolut säilyttivät korkean proliferaatiointensiteetin pitkään, ja substraattiin kiinnittymisen jälkeen viljelmissä, joissa oli alhainen siemennystiheys, ne muodostivat fibroblastien kaltaisten solujen klooneja, joilla ei ollut fagosyyttistä aktiivisuutta. MSC-solujen proliferaation loppuminen päättyi niiden spontaaniin erilaistumiseen in vitro luu-, rasva-, rusto-, lihas- tai sidekudossoluiksi. Lisätutkimukset mahdollistivat eri nisäkäslajien luuytimen stroomassa olevien fibroblastien kaltaisten solujen osteogeenisen potentiaalin sekä niiden pesäkkeitä muodostavan aktiivisuuden selvittämisen. In vivo -kokeet ovat osoittaneet, että sekä hetero- että ortotooppinen pesäkkeitä muodostavien fibroblastien kaltaisten solujen siirto johtaa luu-, rusto-, side- ja rasvakudoksen muodostumiseen. Koska luuytimen stroomakantasoluille on ominaista korkea kyky itsensä uusiutumiseen ja monitahoiseen erilaistumiseen yhden solulinjan sisällä, niitä kutsutaan multipotenteiksi mesenkymaalisiksi progenitorisoluiksi.

On huomattava, että mesenkymaalisten kantasolujen perustutkimuksen yli 45 vuoden aikana on luotu todelliset olosuhteet niiden johdannaisten käytölle kliinisessä käytännössä.

Nykyään ei ole epäilystäkään siitä, että kaikki ihmiskehon kudokset muodostuvat eri solulinjojen kantasoluista lisääntymis-, migraatio-, erilaistumis- ja kypsymisprosessien seurauksena. Vielä äskettäin uskottiin kuitenkin, että aikuisen organismin kantasolut ovat kudoskohtaisia eli kykeneviä tuottamaan erikoistuneiden solujen linjoja vain niistä kudoksista, joissa ne sijaitsevat. Tämän käsitteellisen kannan kumosi hematopoieettisten kantasolujen transformaatio paitsi perifeerisen veren soluelementeiksi, myös maksan soikeiksi soluiksi. Lisäksi hermostolliset kantasolut osoittautuivat kykeneviksi tuottamaan sekä neuroneja että gliasoluelementtejä, samoin kuin varhaisia hematopoieettisten progenitorisolujen linjoja. Mesenkymaaliset kantasolut, jotka yleensä tuottavat luun, ruston ja rasvakudoksen soluelementtejä, pystyvät puolestaan transformoitumaan hermostollisiksi kantasoluiksi. Oletetaan, että kasvun, fysiologisen ja korjaavan kudosregeneraation prosessissa sitoutumattomia progenitorisoluja syntyy kudoskohtaisesti epäspesifisistä kantasolureserveistä. Esimerkiksi lihaskudoksen korjaus voi toteutua mesenkymaalisten kantasolujen siirtymisen ansiosta luuytimestä luustolihaksiin.

Vaikka kaikki tutkijat eivät tunnusta kantasolujen tällaista ristiinvaihdettavuutta, mesenkymaalisten kantasolujen kliinisen käytön mahdollisuutta solusiirtojen lähteenä ja geneettisen tiedon soluvektorina ei enää kukaan kiistä, kuten ei myöskään luuytimen strooman kantasolujen multipotenssia, jotka voidaan suhteellisen helposti eristää ja laajentaa in vitro -viljelmässä. Samaan aikaan tieteellisessä kirjallisuudessa esiintyy edelleen raportteja luuytimen strooman kantasolujen mahdollisesta pluripotenssista. Todisteena mainitaan tutkimusprotokollat, joissa MSC:t transformoituvat spesifisten transdifferentiaatioindusoijien vaikutuksesta hermosoluiksi, sydänlihassoluiksi ja maksasoluiksi. Joillakin tiedemiehillä on kuitenkin vakavia epäilyksiä geenien toistuvan aktivoinnin ja ilmentymisen mahdollisuudesta varhaisen alkionkehityksen aikana. Samaan aikaan kaikki ymmärtävät, että jos löydetään olosuhteet mesenkymaalisten kantasolujen multipotenssin laajentamiseksi alkion kantasolujen pluripotenssiksi, monet regeneratiivisen plastisen lääketieteen eettiset, moraaliset, uskonnolliset ja oikeudelliset ongelmat ratkaistaan automaattisesti. Lisäksi, koska tässä tapauksessa regeneratiivisen kantasolupotentiaalin lähteeksi tulevat potilaan omat autologiset stroomasolut, myös solusiirteen immuunijärjestelmän hylkimisongelma ratkeaa. Lähitulevaisuus näyttää, kuinka realistisia nämä näkymät ovat.

[ 1 ], [ 2 ]

Mesenkymaalisten kantasolujen käyttö lääketieteessä

Kliinisessä käytössä mesenkymaalisten kantasolujohdannaisten käyttö liittyy ensisijaisesti laajojen ja syvien lämpövaurioiden aiheuttamien ihovaurioiden yhteydessä esiintyvien kudosvaurioiden korjaamiseen. Prekliinisessä vaiheessa tehtiin kokeellinen arviointi allogeenisten fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen käyttökelpoisuudesta syvien palovammojen hoidossa. Osoitettiin, että luuytimen fibroblastien kaltaiset mesenkymaaliset kantasolut muodostavat viljelmässä yksisolukerroksen, mikä mahdollistaa niiden siirtämisen syvien palovammojen uudistumisprosessien optimoimiseksi. Kirjoittajat huomauttavat, että alkion fibroblasteilla on samanlainen ominaisuus, mutta niiden kliinistä käyttöä rajoittavat olemassa olevat eettiset ja oikeudelliset ongelmat. Syvä lämpöpalovamma, jossa kaikki ihokerrokset vaurioituivat, mallinnettiin Wistar-rotilla. Palovamma-alue oli 18-20 % ihon kokonaispinta-alasta. Ensimmäiseen kokeelliseen ryhmään kuului rottia, joilla oli syvä lämpöpalovamma ja joille oli siirretty allogeenisiä fibroblastien kaltaisia mesenkymaalisia kantasoluja. Toinen ryhmä koostui eläimistä, joilla oli syvä lämpöpalovamma ja joille oli siirretty allogeenisiä alkion fibroblasteja. Kolmatta ryhmää edustivat kontrollirotat, joilla oli syvä lämpöpalovamma, joille ei tehty soluterapiaa. Fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen ja alkion fibroblastien suspensiota levitettiin palovamman pinnalle pipetillä 2 x ¹⁰⁴soluja toisena päivänä palovammamallinnuksen ja syntyneen nekroottisen ruven poiston jälkeen. Solujensiirron jälkeen palovammapinta peitettiin harsokankaalla, joka oli kostutettu isotonisella natriumkloridiliuoksella ja gentamisiinilla. Luuydinsoluja kerättiin MSC-solujen saamiseksi, ja ne indusoitiin myöhemmin fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen linjaan aikuisilta Wistar-rotilta reisiluista. Alkion fibroblastit saatiin 14–17 päivän ikäisten alkioiden keuhkoista. MSC-solujen saamiseksi alkion fibroblasteja ja luuydinsoluja viljeltiin alustavasti petrimaljoissa 37 °C:n lämpötilassa CO2-inkubaattorissa, 5 % CO2-atmosfäärissä ja 95 %:n kosteudessa. Alkion fibroblasteja viljeltiin 4–6 päivää, kun taas MSC-solujen yksikerroksen muodostuminen kesti 14–17 päivää. Myöhemmin MSC-solut kryosäilöttiin fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen lähtömateriaaliksi, jotka saatiin sulattamalla ja viljelemällä MSC-soluja 4 päivän ajan. Muodostuneiden fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen määrä oli yli kolminkertainen saman viljelyjakson aikana muodostuneiden alkion fibroblastien määrään verrattuna. Siirrettyjen solujen tunnistamiseksi palovammoista viljelyvaiheessa niiden genomi leimattiin käyttämällä virussukkulavektoria, joka perustui rekombinantti-adenovirus tyyppi V:hen, jossa oli E. coli ß-galaktosidaasia koodaava 1ac-2-geeni. Elävät solut eri aikoina siirron jälkeen havaittiin immunohistokemiallisesti kryosektioista, joihin oli lisätty X-Gal-substraattia, joka antoi tunnusomaisen sinivihreän värjäytymän. Palovamman kunnon dynaamisen visuaalisen, planimetrisen ja histologisen arvioinnin tuloksena havaittiin, että jo kolmantena päivänä solusiirron jälkeen havaittiin merkittäviä eroja haavan kulussa valituissa ryhmissä. Tämä ero tuli erityisen selväksi seitsemäntenä päivänä solusiirron jälkeen. Ensimmäisen ryhmän eläimillä, joille siirrettiin fibroblastien kaltaisia mesenkymaalisia kantasoluja, haava sai tasaisen intensiivisen vaaleanpunaisen värin, granulaatiokudos kasvoi koko alueellaan epidermiksen tasolle ja palovamman pinta pieneni merkittävästi. Haavan pinnalle muodostunut kollageenikalvo oheni jonkin verran, mutta se peitti edelleen koko palovamman alueen. Toisen ryhmän eläimillä, joille siirrettiin alkion fibroblasteja, granulaatiokudos nousi haavan reunojen epidermiksen tasolle, mutta vain paikoin, kun taas haavan plasmorrea oli voimakkaampaa kuin ensimmäisessä ryhmässä, ja alun perin muodostunut kollageenikalvo käytännössä katosi. Eläimillä, jotka eivät saaneet soluterapiaa, palovammahaava oli seitsemäntenä päivänä vaalea, kuoppainen, nekroottinen kudos, joka oli peittynyt fibriiniin. Plasmoreaa havaittiin koko palovamman alueella. Histologisesti ensimmäisen ja toisen ryhmän eläimillä havaittiin soluinfiltraation ja verisuoniverkoston kehittymisen vähenemistä.ja nämä alkavan regeneratiivisen prosessin merkit olivat selvempiä 1. ryhmän rotilla. Kontrolliryhmässä havaittiin haavan soluinfiltraation merkkejä, eikä uusien verisuonten histologista kuviota ollut. 15.–30. havainnointipäivänä 1. ryhmän eläinten palovamma-alueen pinta-ala oli merkittävästi pienempi kuin muiden ryhmien rotilla, ja granulaatiopinta oli kehittyneempi. Myös 2. ryhmän eläimillä palovamma-alueen pinta-ala pieneni verrattuna kontrolliryhmän rottien palovammojen kokoon, jotka johtuivat marginaalisesta epitelisaatiosta. Kontrolliryhmässä palovamma-alue pysyi paikoin vaaleana, ja siinä oli harvinaisia granulaatioita, siihen ilmestyi verisuonten tähtiä, fibriinisiä plakkisaarekkeita, kohtalaista plasmorreaa jatkui koko palovamma-alueella, ja joissakin paikoissa oli jäljellä vaikeasti irtoavaa rupea. Yleisesti ottaen 3. ryhmän eläimillä haavan koko pieneni myös, mutta haavan reunat pysyivät uurtuneina.

Niinpä vertailevassa tutkimuksessa haavan paranemisnopeudesta käyttämällä fibroblastin kaltaisia mesenkymaalisia kantasoluja ja alkion fibroblasteja sekä ilman soluterapiaa havaittiin palovamman pinnan paranemisnopeuden kiihtymistä fibroblastin kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen ja alkion fibroblastien siirron seurauksena. Allogeenisten fibroblastin kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen tapauksessa haavan paranemisnopeus oli kuitenkin nopeampi kuin alkion fibroblastien siirron yhteydessä. Tämä ilmeni regeneratiivisen prosessin vaiheiden muutoksen kiihtymisenä - solujen infiltraation ajat lyhenivät, verisuoniverkoston kasvunopeus lisääntyi sekä granulaatiokudoksen muodostuminen lisääntyi.

Dynaamisen planimetrian tulokset osoittavat, että palovamman spontaanin paranemisnopeus (ilman soluterapiaa) oli alhaisin. Allogeenisten fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen siirron jälkeisinä 15. ja 30. päivänä haavan paranemisnopeus oli korkeampi kuin alkion fibroblastien siirron jälkeen. Histokemiallinen menetelmä beeta-galaktosidaasin havaitsemiseksi osoitti, että fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen ja alkion fibroblastien siirron jälkeen siirretyt solut pysyvät elinkelpoisina regeneroituvien haavojen pinnalla ja syvyydessä koko havaintojakson ajan. Kirjoittajat uskovat, että fibroblastien kaltaisten mesenkymaalisten kantasolujen käytön korkeampi palovamman regeneroitumisnopeus johtuu näiden solujen vapauttamista biologisesti aktiivisista kasvua stimuloivista tekijöistä kypsymisprosessin aikana.

Kliinisessä käytännössä on käytetty myös auto- tai allogeenisten keratinosyyttien ja allogeenisten fibroblastien siirtoa palovammojen hoitoon. On huomattava, että lasten laajojen syvien palovammojen kirurginen hoito on monimutkainen tehtävä johtuen niiden suuresta traumaattisuudesta ja useista kirurgisista toimenpiteistä, merkittävästä verenhukasta ja erilaisista reaktioista käytettyihin infuusionesteisiin. Suurimmat vaikeudet laajojen syvien palovammojen, joiden pinta-ala on yli 40 % kehon pinta-alasta, ihon plastiikkakirurgioiden suorittamisessa johtuvat uhrien tilan vakavuudesta ja luovuttajien ihoresurssien puutteesta. Suuren perforaatiokertoimen omaavien verkkosiirteiden käyttö ei ratkaise ongelmaa, koska perforaation jälkeen muodostuneet solut epitelisoituvat hyvin hitaasti ja itse iholäpät usein hajoavat tai kuivuvat. Palovammojen peitteet, kuten ksenoskini, ruumiinavajaallosiirteet ja synteettiset kalvopäällysteet, eivät aina ole riittävän tehokkaita, joten kehitetään uusia menetelmiä palovammojen peittämiseksi viljeltyjen keratinosyyttien ja fibroblastien kerroksilla. Erityisesti on ehdotettu menetelmää palovammapintojen peittämiseksi viljeltyjen allofibroblastien avulla, joilla siirrettäessä on voimakas stimuloiva vaikutus rajatapauspalovammojen haavassa säilyneiden epidermosyyttien sekä verkkosiirteiden väliseinien keratinosyyttien lisääntymiseen. L. Budkevichin ja hänen yhteistyökumppaneidensa (2000) työ esittelee tuloksia tämän menetelmän käytöstä lasten palovammojen hoidossa. Tutkimukseen osallistui 31 lämpövamman saanutta lasta, jotka olivat iältään 1 vuodesta 14 vuoteen. Kolmella lapsella IIIA-B-IV-asteiden palovammojen kokonaispinta-ala oli 40 %, 25 lapsella 50-70 % ja kolmella muulla 71-85 % kehon pinta-alasta. Varhainen kirurginen nekrektomia yhdistettiin viljeltyjen allofibroblastien siirtoon ja autodermoplastiaan. Ensimmäisessä hoitovaiheessa poistettiin nekroottisia kudoksia, toisessa vaiheessa viljeltyjä allofibroblasteja siirrettiin kantajakalvoille ja kolmannessa vaiheessa (48 tuntia viljeltyjen allofibroblastien siirron jälkeen) poistettiin matriisi ja tehtiin autodermoplastia iholäppien kanssa perforaatiosuhteella 1:4. Kolmelle potilaalle, jotka otettiin klinikalle vaikean palovamman vuoksi, oli siirretty viljeltyjä allofibroblasteja granulaatiohaavoihin. Viljeltyjä allofibroblasteja siirrettiin kerran 18 lapselle, kahdesti 11 lapselle ja kolme kertaa kahdelle potilaalle. Soluviljelmällä peitetty haavan pinta-ala vaihteli 30:stä 3500 cm2:iin. Viljeltyjen allofibroblastien tehokkuutta arvioitiin ihosiirteen kiinnittymisen kokonaisprosentin, palovammojen paranemisajan ja vakavasta lämpövammasta johtuvien kuolemantapausten lukumäärän perusteella. Siirteen kiinnittyminen oli täydellistä 86 %:lla potilaista. Ihosiirteiden osittaista kiinnittymättömyyttä havaittiin 14 %:lla tapauksista. Hoidosta huolimatta kuusi (19,3 %) lasta kuoli. Ihovaurioiden kokonaispinta-ala niissä vaihteli 40–70 prosentin välillä kehon pinta-alasta.Viljeltyjen allofibroblastien siirto ei liittynyt palovammakuolleisuuteen kenelläkään potilaalla.

Hoitotuloksia analysoidessaan kirjoittajat toteavat, että aiemmin syviä, 35–40 % kehon pinta-alasta peittäviä lämpövaurioita pidettiin elämän kanssa yhteensopimattomina (pienemmillä lapsilla – alle 3-vuotiailla – 30 % kehon pinta-alasta peittävät syvät palovammat ovat kriittisiä, vanhemmilla lapsilla yli 40 % kehon pinta-alasta peittävät palovammat). Kirurgisessa nekrektomiassa, johon liittyy viljeltyjen allofibroblastien siirto ja sitä seuraava autodermoplastia, jossa käytetään korkean perforaatiokertoimen omaavia iholäppiä, IIIB–IV asteen palovammat ovat edelleen kriittisiä, mutta tällä hetkellä on olemassa mahdollisuuksia pelastaa jopa tällaisten uhrien henki monissa tapauksissa. Kirurginen nekrektomia yhdessä viljeltyjen allofibroblastien siirron ja autodermoplastian kanssa lapsilla, joilla on syviä palovammoja, on osoittautunut erityisen tehokkaaksi potilailla, joilla on laajalle levinneitä ihovaurioita ja pulaa luovutuskohdista. Aktiiviset kirurgiset taktiikat ja viljeltyjen allofibroblastien siirtäminen edistävät tällaisten potilaiden yleisen tilan nopeaa vakautumista, vähentävät palovammojen tarttuvien komplikaatioiden määrää, luovat suotuisat olosuhteet siirteiden kiinnittymiselle, lyhentävät menetettyä ihoa ja lyhentävät sairaalahoidon kestoa sekä vähentävät kuolemaan johtavien tulosten esiintyvyyttä laajojen palovammojen uhreilla. Näin ollen viljeltyjen allofibroblastien siirtäminen ja sitä seuraava autodermoplastia iholäppien kanssa mahdollistaa toipumisen vakavista palovammoista kärsivillä lapsilla, joita aiemmin pidettiin tuhoon tuomittuina.

Yleisesti pidetään palovamman hoidon ensisijaisena tavoitteena olevan vaurioituneen ihon mahdollisimman täydellinen ja nopea palauttaminen toksisten vaikutusten, infektiokomplikaatioiden ja nestehukan estämiseksi. Viljeltyjen solujen käytön tulokset riippuvat pitkälti itse palovamman valmiudesta siirtoon. Kun viljeltyjä keratinosyyttejä siirretään haavan pinnalle kirurgisen nekrektomian jälkeen, keskimäärin 55 % (pinta-alasta) siirretyistä soluista kiinnittyy, kun taas granulaatiohaavoissa kiinnittymisaste laskee 15 prosenttiin. Siksi laajojen syvien ihopalovammojen onnistunut hoito vaatii ensinnäkin aktiivisia kirurgisia taktiikoita. IIIB-IV asteen palovammoissa palovammapinta vapautetaan välittömästi nekroottisesta kudoksesta myrkytyksen vähentämiseksi ja palovamman komplikaatioiden määrän vähentämiseksi. Tällaisten taktiikoiden käyttö on avainasemassa palovamman saamisesta haavan sulkeutumiseen kuluvan ajan lyhentämisessä ja laajoista palovammoista kärsivien potilaiden sairaalahoidon keston lyhentämisessä. Se myös vähentää merkittävästi kuolemaan johtaneiden tapausten määrää.

Ensimmäiset raportit viljeltyjen keratinosyyttien onnistuneesta käytöstä palovammapintojen peittämiseen ilmestyivät 1980-luvun alussa. Myöhemmin tämä manipulointi suoritettiin käyttämällä viljeltyjen keratinosyyttien kerroksia, jotka useimmiten saatiin autosoluista, paljon harvemmin allokeratinosyyteistä. Autokeratinosytoplastian teknologia ei kuitenkaan mahdollista solupankin luomista, ja riittävän kokoisen keratinosyyttisiirteen tuottamiseen tarvittava aika on pitkä ja kestää 3-4 viikkoa. Tänä aikana palovamman infektio- ja muiden komplikaatioiden kehittymisen riski kasvaa jyrkästi, mikä pidentää merkittävästi potilaiden sairaalassaoloaikaa. Lisäksi autokeratinosyytit eivät käytännössä juurru, kun ne siirretään granuloituviin palovammoihin, ja erityisten kasvualustojen ja biologisesti aktiivisten keratinosyyttien kasvua stimuloivien aineiden korkea hinta rajoittaa merkittävästi niiden kliinistä käyttöä. Muut bioteknologiset menetelmät, kuten kollageeniplastia, kryosäilytetyn ksenoskinin siirto ja erilaisten biopolymeeripinnoitteiden käyttö, lisäävät laajojen pinnallisten, mutta ei syvien palovammojen hoidon tehokkuutta. Menetelmä haavan pinnan peittämiseksi viljellyillä fibroblasteilla on perustavanlaatuisesti erilainen siinä, että viljellyn solukerroksen pääkomponenttina käytetään fibroblasteja keratinosyyttien sijaan.

Menetelmän kehittämisen edellytyksenä oli tieto siitä, että pieniä verisuonia ympäröivät perisyytit ovat mesenkymaalisia progenitorisoluja, jotka kykenevät muuntautumaan fibroblasteiksi, jotka tuottavat monia kasvutekijöitä ja varmistavat haavan paranemisen voimakkaan keratinosyyttien lisääntymistä ja kiinnittymistä stimuloivan vaikutuksen ansiosta. Viljeltyjen fibroblastien käyttö haavapintojen sulkemiseen paljasti välittömästi useita merkittäviä etuja tässä menetelmässä verrattuna viljeltyjen keratinosyyttien käyttöön. Erityisesti fibroblastien saaminen viljelyssä ei vaadi erityisten ravintoalustojen ja kasvustimulanttien käyttöä, mikä alentaa siirteen kustannuksia yli 10 kertaa keratinosyyttien saamisen kustannuksiin verrattuna. Fibroblastit passivoituvat helposti, jolloin ne menettävät osittain pinnan histokompatibiliteettiantigeenejä, mikä puolestaan avaa mahdollisuuden käyttää allogeenisiä soluja siirteiden valmistukseen ja niiden pankkien luomiseen. Klinikalla käyttövalmiiden siirteiden saamiseen tarvittava aika lyhenee 3 viikosta (keratinosyyteillä) 1-2 päivään (fibroblasteilla). Primaarinen fibroblastiviljelmä voidaan saada viljelemällä soluja autodermoplastian aikana otetuista ihopaloista, ja solujen kylvötiheys ihmisen fibroblastialisoluviljelmien saamiseksi on vain 20 x 103 ^per 1 ^cm2.

Fibroblastien ja niiden säätelyproteiinien vaikutuksen tutkimiseksi keratinosyyttien proliferaatioon ja erilaistumiseen suoritettiin vertaileva analyysi keratinosyyttien morfologiasta ja proliferaatiosta kollageenityyppien I ja III alustoilla sekä fibronektiinillä yhteisviljelyssä ihmisen fibroblastien kanssa. Ihmisen keratinosyytit eristettiin palovammapotilaiden ihopaloista, jotka otettiin autodermoplastian aikana. Keratinosyyttien siementiheys oli 50 x 103 solua / 1 cm2. Viljellyn fibroblastisiirron kliinistä tehokkuutta arvioitiin 517 potilaalla. Kaikki potilaat jaettiin kahteen ryhmään: Ryhmä 1 - aikuiset, joilla oli IIA-, B-IV-asteen palovammoja; Ryhmä 2 - lapset, joilla oli IIIB-IV-asteen syviä palovammoja. Yksikerroksisten fibroblastiviljelmien rakenteellisen ja toiminnallisen organisaation dynamiikan arviointi ottaen huomioon glykosaminoglykaanien, fibronektiinin ja kollageenin roolin regeneraatioprosesseissa mahdollisti kirjoittajille kolmannen päivän määrittämisen edullisimmaksi ajaksi fibroblastiviljelmien käytölle siirtojen tekemiseen. Tutkimus fibroblastien vaikutuksesta keratinosyyttien proliferaatioon ja erilaistumiseen osoitti, että in vitro fibroblasteilla on voimakas stimuloiva vaikutus, pääasiassa keratinosyyttien adheesioprosesseihin, lisäämällä kiinnittyneiden solujen määrää ja niiden kiinnittymisnopeutta yli kaksinkertaisesti. Adheesioprosessien stimulaatioon liittyy DNA-synteesin intensiteetin ja keratinosyyttien proliferaation tason kasvu. Lisäksi kävi ilmi, että fibroblastien ja niiden muodostaman solunulkoisen matriisin läsnäolo on välttämätön edellytys keratinosyyttien tonofibrillaarisen laitteen muodostumiselle, solujen välisille yhteyksille ja lopulta keratinosyyttien erilaistumiselle ja tyvikalvon muodostumiselle. Syvien palovammojen hoidossa lapsilla on todettu allofibroblastiviljelmän siirron korkea kliininen tehokkuus, erityisesti potilasryhmässä, jolla on laajoja ihovaurioita luovuttajakohdan puutteen olosuhteissa. Kattava morfofunktionaalinen tutkimus on osoittanut, että siirrettyjen fibroblastien ominaispiirteitä on aktiivinen DNA:n sekä kollageenin, fibronektiinin ja glykosaminoglykaanien synteesi, jotka ovat osa solujen muodostamaa solunulkoista matriisia. Kirjoittajat viittaavat siirrettyjen fibroblastien korkeaan kiinnittymisprosenttiin (jopa 96 %), niiden vastaanottoajan jyrkkään lyhenemiseen (24–48 tunnin sisällä 2–3 viikon sijaan keratinosyyttien tapauksessa), palovamman pinnan epitelisaation merkittävään nopeutumiseen sekä fibroblasteista kasvatettavan siirteen teknologian kustannusten merkittävään alenemiseen (10-kertaisesti) verrattuna keratinosyyttien siirtoon. Viljeltyjen allofibroblastien siirron käyttö mahdollistaa vakavien palovammojen – yli 50 %:n kehon pinta-alasta lämpövaurioiden – saaneiden lasten hengen pelastamisen.jota aiemmin pidettiin elämän kanssa yhteensopimattomana. On huomattava, että allogeenisten alkion fibroblastien siirroilla on vakuuttavasti todistettu paitsi nopeampaa haavan uudistumista ja eriasteisten ja -alueisten palovammojen omaavien potilaiden toipumista, myös heidän kuolleisuutensa merkittävää vähenemistä.

Autologisia fibroblasteja käytetään myös niin monimutkaisella plastiikkakirurgian alueella kuin äänihuulten vammojen rekonstruktiivisessa korjauksessa. Tähän tarkoitukseen käytetään yleensä naudan kollageenia, jonka vaikutusaikaa rajoittaa sen immunogeenisyys. Vieraana proteiinina naudan kollageeni on herkkä vastaanottajan kollagenaasille ja voi aiheuttaa immuunireaktioita, joiden riskin vähentämiseksi on kehitetty teknologioita glutaraldehydillä silloitettujen kollageenivalmisteiden saamiseksi. Niiden etuna on suurempi stabiilius ja alhaisempi immunogeenisyys, mikä on löytänyt käytännön sovellusta äänihuulten vikojen ja surkastumisen poistamisessa. Autologisen kollageenin injektioita käytettiin ensimmäisen kerran vuonna 1995. Tekniikka varmisti autologisten kollageenikuitujen primaarirakenteen säilymisen, mukaan lukien molekyylinsisäiset entsymaattisesti katalysoidut silloitetut sidokset. Tosiasia on, että luonnolliset kollageenikuidut ovat vastustuskykyisempiä proteaasien aiheuttamalle tuhoamiselle kuin rekonstruktiivinen kollageeni, jossa telopeptidit on katkaistu. Telopeptidien eheys on tärkeää kollageenikuitujen kvaternääriselle rakenteelle ja silloittuneiden sidosten muodostumiselle vierekkäisten kollageenimolekyylien välille. Toisin kuin naudan kollageenivalmisteet, autologinen kollageeni ei aiheuta immuunireaktioita vastaanottajalla, mutta se ei ole riittävän tehokas täydentävänä aineena. Vakaa korjaus voidaan saavuttaa paikallisella kollageenin tuotannolla siirtämällä autologisia fibroblasteja. Autologisen fibroblastisiirron tehokkuutta kliinisessä tutkimuksessa havaittiin kuitenkin tiettyjä vaikeuksia. Fibroblastisiirron jälkeisessä varhaisessa vaiheessa kliininen vaikutus oli heikompi verrattuna naudan kollageenin käyttöönoton jälkeiseen aikaan. Autologisia fibroblasteja viljeltäessä ei voida sulkea pois mahdollisuutta, että normaalit fibroblastit muuttuvat patologisiksi, niin sanotuiksi myofibroblasteiksi, jotka ovat vastuussa fibroosin ja arven muodostumisesta, mistä on osoituksena fibroblastien ja kollageenifibrillien spesifisen vuorovaikutuksen aiheuttama kollageenigeelin supistuminen. Lisäksi in vitro -jaksojen jälkeen fibroblastit menettävät kyvyn syntetisoida solunulkoisia matriisiproteiineja.

Autologisten ihmisen fibroblastien viljelyyn on kuitenkin nyt kehitetty kokeellisesti menetelmä, joka poistaa edellä mainitut puutteet eikä johda normaalien fibroblastien onkogeeniseen transformaatioon. Tällä menetelmällä saatuja autologisia fibroblasteja käytetään kasvojen pehmytkudosten virheiden korjaamiseen. G. Kellerin ym. (2000) tutkimuksessa hoidettiin 20:tä 37–61-vuotiasta potilasta, joilla oli ryppyjä ja atrofisia arpia. Retroaurikulaariselta alueelta otetut ihobiopsiat (4 mm) kuljetettiin laboratorioon steriileissä koeputkissa, jotka sisälsivät 10 ml viljelyalustaa (Eaglen elatusaine, jossa oli antibioottia, mykoseptista, pyruvaattia ja vasikan sikiön seerumia). Materiaali asetettiin 3–5 halkaisijaltaan 60 mm olevaan viljelymaljaan ja inkuboitiin termostaatissa, jonka ilmakehä sisälsi 5 % CO2:ta. Viikon kuluttua solut poistettiin maljoista trypsinoimalla ja asetettiin 25 cm2:n injektiopulloihin. Soluja injektoitiin potilaisiin 4 x 107 määränä. Merkittävä ja pysyvä kliininen vaikutus havaittiin potilailla nenän ja suun välisten poimujen korjauksen aikana, samoin kuin potilailla, joilla oli arpia 7 ja 12 kuukautta kolmannen autologisen fibroblastisiirron jälkeen. Virtaussytometrian mukaan viljellyt fibroblastit tuottivat suuren määrän tyypin I kollageenia. In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet injektoitujen fibroblastien normaalin supistuvuuden. Kaksi kuukautta viljeltyjen fibroblastien ihonalaisen annon jälkeen annoksella 4 x 107 solua, nude-hiirillä ei havaittu kasvaimia. Injektoidut fibroblastit eivät aiheuttaneet arpeutumista tai diffuusia fibroosia potilailla. Kirjoittajan mukaan siirretyt autologiset fibroblastit kykenevät jatkuvasti tuottamaan kollageenia, mikä tarjoaa kosmeettisen nuorennusvaikutuksen. Samalla, koska erilaistuneiden solujen elinkaari on rajallinen, nuorelta potilaalta otetut fibroblastit ovat tehokkaampia kuin iäkkäiltä ihmisiltä saadut. Tulevaisuudessa oletetaan, että nuorelta luovuttajalta otettujen fibroblastien viljelmä voidaan kryosäilyttää, jotta myöhemmin luovuttajan omat nuoret solut voidaan siirtää iäkkäälle potilaalle. Yhteenvetona voidaan todeta, että ei ole täysin oikein päätellä, että autologiset fibroblastit, edellyttäen että ne ovat toiminnallisesti säilyneitä, olisivat ihanteellinen keino korjata kasvojen pehmytkudosten puutteita. Samalla kirjoittaja itse huomauttaa, että tutkimuksen aikana ilmeni joitakin autologisen fibroblasti-kollageenijärjestelmän käyttöön liittyviä ongelmatilanteita. Kliininen vaikutus oli usein heikompi kuin naudan kollageenia käytettäessä, mikä aiheutti pettymystä potilailla.

Yleisesti ottaen kirjallisuustiedot mesenkymaalisten kantasolujen kliinisen käytön näkymistä näyttävät varsin optimistisilta. Autologisia luuytimen multipotentteja mesenkymaalisia kantasoluja yritetään käyttää degeneratiivisten nivelvaurioiden hoitoon. Ensimmäisiä kliinisiä tutkimuksia viljeltyjen mesenkymaalisten kantasolujen käytöstä monimutkaisten luunmurtumien hoidossa tehdään parhaillaan. Auto- ja allogeenisiä mesenkymaalisia luuytimen stroomasoluja käytetään rustokudoksen luomiseen siirtoa varten traumasta tai autoimmuunivaurioista johtuvien nivelrustovaurioiden korjaamiseksi. Menetelmiä kehitetään multipotenttien mesenkymaalisten kantasolujen kliiniseen käyttöön luuvaurioiden poistamiseksi lapsilla, joilla on vaikea epätäydellinen osteogeneesin muoto, joka johtuu tyypin I kollageenigeenin mutaatioista. Myeloablaation jälkeen vastaanottaville lapsille siirretään luuydintä HLA-yhteensopivilta terveiltä luovuttajilta, koska fraktioimaton luuydin voi sisältää riittävän määrän mesenkymaalisia kantasoluja vakavan luuvaurion kompensoimiseksi. Allogeenisen luuytimen siirron jälkeen tällaisilla lapsilla on havaittu positiivisia histologisia muutoksia trabekulaarisissa luissa, kasvunopeuden lisääntymistä ja luunmurtumien esiintyvyyden vähenemistä. Joissakin tapauksissa positiivinen kliininen tulos saavutetaan siirtämällä läheisesti sukua olevaa allogeenista luuydintä ja osteoblasteja. MSC-siirtoa käytetään myös synnynnäisen luun haurauden hoitoon, joka johtuu osteoblastien ja osteoklastien epätasapainosta luukudoksessa. Tässä tapauksessa luunmuodostuksen palauttaminen saavutetaan kimerisoimalla potilaiden luukudoksen kantasolujen ja progenitorisolujen pooli.

Luovuttajan mesenkymaalisten kantasolujen geneettisen modifioinnin menetelmien parantamista strooman kudosten geneettisten vikojen korjaamiseksi jatketaan. Oletetaan, että lähitulevaisuudessa mesenkymaalisia progenitorisoluja käytetään neurologiassa aivosolujen kohdennettuun kimerisointiin ja terveen solupoolin luomiseen, joka kykenee tuottamaan puutteellisen entsyymin tai tekijän, joka on vastuussa taudin kliinisistä ilmentymistä. Mesenkymaalisten kantasolujen siirtoa voidaan käyttää luuytimen strooman palauttamiseen syöpäpotilailla säde- ja kemoterapian jälkeen ja yhdessä luuydinsolujen kanssa hematopoieesin palauttamiseen. Mesenkymaalisten kantasolujen avulla tapahtuvan tuki- ja liikuntaelimistön vikojen poistamiseen tähtäävän korvaushoidon kehittämistä edistävät tekniset kehitysaskeleet matriisibiomateriaalien tai biomimeettien suunnittelussa, jotka muodostavat mesenkymaalisten kantasolujen jälkeläisten täyttämiä kehyksiä.

Mesenkymaalisten kantasolujen lähteet

Mesenkymaalisten kantasolujen pääasiallinen lähde on luuydin, jonka hematopoieettiset kantasolut nisäkkäiden kehossa erilaistuvat jatkuvasti veri- ja immuunijärjestelmän soluiksi, kun taas mesenkymaalisia kantasoluja edustaa pieni populaatio luuytimen strooman fibroblastien kaltaisia soluja, ja ne edistävät hematopoieettisten kantasolujen erilaistumattoman tilan säilymistä. Tietyissä olosuhteissa mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat rusto- ja luukudossoluiksi. Kun luuytimen mononukleaariset stroomasolut kylvetään viljelyalustalle matalan tiheyden olosuhteissa, ne muodostavat adheesiosolujen pesäkkeitä, jotka ovat itse asiassa fibroblastien kaltaisia multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja. Jotkut kirjoittajat uskovat, että sitoutumattomat mesenkymaaliset kantasolut kerrostuvat luuytimeen, jotka itsensä uusiutumiskyvyn ja korkean erilaistumispotentiaalinsa ansiosta tarjoavat kaikille kehon kudoksille stroomaelementtien mesenkymaalisia esiasteita koko nisäkkään elimistön elinkaaren ajan.

Luuytimessä stroomasoluelementit muodostavat verkoston, joka täyttää sinusoidien ja luukudoksen välisen tilan. Aikuisen luuytimessä lepotilassa olevien mesenkymaalisten kantasolujen (MSC) määrä on verrattavissa hematopoieettisten kantasolujen määrään eikä ylitä 0,01–0,001 %. Luuytimestä eristetyistä ja viljelemättömistä mesenkymaalisista kantasoluista puuttuu adheesiomolekyylejä. Tällaiset MSC:t eivät ilmennä CD34:ää, ICAM:ia, VCAM:ia, kollageenityyppejä I ja III, CD44:ää ja CD29:ää. Näin ollen in vitro viljelyalustalle ei kiinnity mesenkymaalisia kantasoluja, vaan mesenkymaalisten kantasolujen kehittyneempiä progenitorijohdannaisia, jotka ovat jo muodostaneet sytoskeletonin ja soluadheesiomolekyylien reseptorilaitteiston komponentit. CD34-fenotyyppisiä stroomasoluja löytyy jopa perifeerisestä verestä, vaikka luuytimessä niitä on huomattavasti vähemmän kuin CD34-positiivisia mononukleaarisia soluja. Verestä eristetyt ja viljelyyn siirretyt CD34-solut kiinnittyvät substraattiin ja muodostavat fibroblastien kaltaisten solujen pesäkkeitä.

Tiedetään, että alkionvaiheessa kaikkien nisäkkäiden ja ihmisten elinten ja kudosten stroomapohja muodostuu yhteisestä mesenkymaalisten kantasolujen poolista ennen organogeneesiä ja sen aikana. Siksi uskotaan, että kypsässä organismissa suurin osa mesenkymaalisista kantasoluista on side- ja luukudoksessa. On todettu, että löysän side- ja luukudoksen strooman soluelementtien pääosa koostuu sitoutuneista progenitorisoluista, jotka kuitenkin säilyttävät kyvyn lisääntyä ja muodostaa klooneja in vitro. Kun tällaisia soluja viedään yleiseen verenkiertoon, yli 20 % mesenkymaalisista progenitorisoluista kiinnittyy hematopoieettisen kudoksen ja parenkyymielinten stroomaelementteihin.

Mesenkymaalisten kantasolujen mahdollinen lähde on rasvakudos, jonka kantasoluista on tunnistettu vaihtelevassa määrin sitoutuneita adiposyyttien esiasteita. Rasvakudoksen vähiten kypsät progenitorielementit ovat strooma-vaskulaarisia soluja, jotka, kuten luuytimen multipotentit mesenkymaaliset esiasteet, kykenevät erilaistumaan adiposyyteiksi glukokortikoidien, insuliinin kaltaisen kasvutekijän ja insuliinin vaikutuksesta. Viljelmässä strooma-vaskulaariset solut erilaistuvat adiposyyteiksi ja kondrosyyteiksi, ja luuytimestä peräisin olevassa rasvakudoksessa on soluja, jotka muodostavat adiposyyttejä ja osteoblasteja.

Strooman kantasoluja on löydetty myös lihaksista. Ihmisen luustolihaksesta eristettyjen solujen primaariviljelmässä havaitaan stellaattisoluja ja monitumaisia myotubeja. Hevosen seerumin läsnä ollessa stellaattisolut lisääntyvät in vitro ilman sytodifferentiaation merkkejä, ja deksametasonin lisäämisen jälkeen ravintoalustaan niiden erilaistumiselle on ominaista luusto- ja sileiden lihassolujen, luun, ruston ja rasvakudoksen fenotyypin omaavien soluelementtien esiintyminen. Siksi ihmisen lihaskudoksessa on sekä sitoutuneita että sitoutumattomia multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja. On osoitettu, että luustolihaksissa olevien progenitorisolujen populaatio on peräisin luuytimen sitoutumattomista multipotenteista mesenkymaalisista progenitorisoluista ja eroaa myogeenisistä satelliittisoluista.

Vastasyntyneiden rottien sydänlihaksesta löydettiin myös adhesiivisia tähtisoluja, jotka vastaavat erilaistumispotentiaalilla varustettuja multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja, koska deksametasonin vaikutuksesta ne erilaistuvat adiposyyteiksi, osteoblasteiksi, kondrosyyteiksi, sileiksi lihassoluiksi, luustolihasten myotubuksiksi ja kardiomyosyyteiksi. Osoitettiin, että verisuonten sileät lihassolut (perisyytit) ovat erilaistumattomien perivaskulaaristen multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen johdannaisia. Viljelmässä perivaskulaariset mesenkymaaliset kantasolut ilmentävät sileän lihaksen a-aktiinia ja verihiutaleista peräisin olevaa kasvutekijäreseptoria ja kykenevät erilaistumaan ainakin sileiksi lihassoluiksi.

Varren varastojen näkökulmasta erityisellä paikalla on rustokudos, jonka erittäin alhaisen korjauspotentiaalin uskotaan johtuvan multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen tai erilaistumis- ja kasvutekijöiden puutteesta. Oletetaan, että kondro- ja osteogeneesiin sitoutuneet multipotentit mesenkymaaliset progenitorisolut pääsevät rustokudokseen muista kudoslähteistä.

Mesenkymaalisten progenitorisolujen kudosperää ja sitoutumisolosuhteita jänteisiin ei myöskään ole selvitetty. Kokeelliset havainnot osoittavat, että varhaisella postnataalisella ajanjaksolla kaniinin akillesjänteen solut säilyttävät tyypin I kollageenin ja dekoriinin ilmentymisen primaariviljelmissä ja ensimmäisessä siirrostuksessa, mutta jatkoviljelyssä ne menettävät tenosyyttien erilaistumismarkkerit.

On huomattava, että vastausta kysymykseen siitä, onko eri kudoksiin lokalisoituneita multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja todella jatkuvasti läsnä stroomassaan vai täydentyykö mesenkymaalisten kantasolujen kudospooli luuytimen stroomasolujen migraation avulla, ei ole vielä saatu.

Aikuisen organismin luuytimen ja muiden mesenkymaalisten kudosalueiden lisäksi napanuoraveri voi olla toinen mesenkymaalisten kantasolujen lähde. On osoitettu, että napanuoraverestä eristetään soluja, joilla on samanlaiset morfologiset ja antigeeniset ominaisuudet kuin multipotenteilla mesenkymaalisilla kantasoluilla, jotka kykenevät adheesioon eivätkä ole erilaistumispotentiaaliltaan huonompia kuin luuytimestä peräisin olevat multipotentit mesenkymaaliset kantasolut. Napanuoraveren mesenkymaalisten kantasolujen viljelmissä löydettiin 5–10 % sitoutumattomia multipotentteja mesenkymaalisia kantasoluja. Kävi ilmi, että niiden määrä napanuoraveressä on kääntäen verrannollinen raskausikään, mikä epäsuorasti osoittaa multipotenttien mesenkymaalisten kantasolujen kulkeutumista eri kudoksiin sikiönkehityksen aikana. Ensimmäiset tiedot napanuoraverestä eristettyjen mesenkymaalisten kantasolujen sekä alkion biomateriaalista saatujen kantasolujen kliinisestä käytöstä ovat ilmestyneet, ja ne perustuvat sikiön kantasolujen tunnettuun kykyyn integroitua, kiinnittyä ja toimia aikuisten vastaanottajien elimissä ja kudosjärjestelmissä.

Etsi uusia mesenkymaalisten kantasolujen lähteitä

Alkion alkuperää olevien mesenkymaalisten kantasolujen, kuten myös muiden sikiösolujen, käyttö aiheuttaa useita eettisiä, oikeudellisia, oikeudellisia ja lainsäädännöllisiä ongelmia. Siksi alkion ulkopuolisen luovuttajasolumateriaalin etsintä jatkuu. Yritys ihmisen ihon fibroblastien kliiniseen käyttöön epäonnistui, mikä johtui paitsi teknologian korkeasta taloudellisesta kapasiteetista, myös fibroblastien nopeasta erilaistumisesta fibrosyyteiksi, joilla on huomattavasti alhaisempi proliferaatiopotentiaali ja jotka tuottavat rajoitetun määrän kasvutekijöitä. MSC-solujen ja luuytimen multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen biologian tutkimuksen edistyminen mahdollisti strategian kehittämisen autologisten mesenkymaalisten kantasolujen kliiniseen käyttöön. Niiden eristämisen, viljelyn, ex vivo -lisäyksen ja kohdennetun erilaistumisen teknologia edellytti ensinnäkin MSC-solujen molekyylimarkkereiden spektrin tutkimista. Heidän analyysinsä osoitti, että ihmisen luukudoksen primaariviljelmät sisältävät useita erityyppisiä multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja. Proosteoblastifenotyyppi havaittiin soluissa, jotka ilmensivät strooman progenitorisolujen STRO-1-markkeria, mutta eivät kantaneet osteoblastimarkkeria - alkalista fosfataasia. Tällaisille soluille on ominaista heikko kyky muodostaa mineralisoitunutta luumatriisia, sekä osteopontiinin ja lisäkilpirauhashormonireseptorien ilmentymisen puuttuminen. STRO-1-positiivisten solujen johdannaisia, jotka eivät ilmennä alkalista fosfataasia, edustavat välillisesti ja täysin erilaistuneet osteoblastit. Havaittiin, että STRO-1-positiivisten ihmisen trabekulaaristen luusolujen kloonattujen linjojen soluelementit kykenevät erilaistumaan kypsiksi osteosyyteiksi ja adiposyyteiksi. Näiden solujen erilaistumisen suunta riippuu monityydyttymättömien rasvahappojen, tulehdusta edistävien sytokiinien - IL-1b:n ja tuumorinekroositekijä a:n (TNF-a) - sekä tulehdusta estävän ja immunosuppressiivisen TGF-b:n vaikutuksesta.

Myöhemmin havaittiin, että multipotenteilla mesenkymaalisilla progenitorisoluilla ei ole niille ominaista spesifistä fenotyyppiä, mutta ne ilmentävät mesenkymaalisille, endoteeli-, epiteeli- ja lihassoluille ominaista markkerikompleksia hematopoieettisten solujen immunofenotyyppisten antigeenien - CD45:n, CD34:n ja CD14:n - ilmentymisen puuttuessa. Lisäksi mesenkymaaliset kantasolut tuottavat konstitutiivisesti ja indusoitavasti hematopoieettisia ja ei-hematopoieettisia kasvutekijöitä, interleukiineja ja kemokiineja, ja joidenkin sytokiinien ja kasvutekijöiden reseptoreita ilmentyy multipotenteissa mesenkymaalisissa progenitorisoluissa. Ihmiskehon stroomatriisin soluista on löydetty lepotilassa olevia soluja, joiden immunofenotyyppi on lähes identtinen 5-fluorourasiililla käsittelemättömien multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen antigeeniprofiilin kanssa - molemmat solut ilmentävät CD117:ää, joka merkitsee "aikuisia" kantasoluja.

Näin ollen mesenkymaalisille kantasoluille ainutlaatuista solumerkkiainetta ei ole vielä tunnistettu. Oletetaan, että lepotilassa olevat solut edustavat sitoutumattomien multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen populaatiota, koska ne eivät ilmennä osteo- (Cbfa-1) tai adipogeneesiin (PPAR-y-2) sitoutuneiden solujen markkereita. Hitaasti lisääntyvien lepotilassa olevien solujen pitkäaikainen altistuminen naudan sikiön seerumille johtaa terminaalisesti erilaistuvien sitoutuneiden progenitorien muodostumiseen, joille on ominaista nopea kasvu. Tällaisten mesenkymaalisten kantasolujen klonaalista laajenemista tukee FGF2. Näyttää siltä, että strooman kantasolujen genomi on melko tiukasti "suljettu". On raportteja spontaanin erilaistumisen puuttumisesta mesenkymaalisissa kantasoluissa - ilman erityisiä sitoutumisolosuhteita ne eivät transformoidu edes mesenkymaalisen linjan soluiksi.

Mesenkymaalisten kantasolujen johdannaisten populaatiorakenteen tutkimiseksi etsitään erilaistumismarkkeriproteiineja stroomasolulinjoista ja primaariviljelmistä. Luuytimen pesäkkeitä muodostavien solujen in vitro -klonaaliset analyysit ovat osoittaneet, että EGF lisää keskimääräistä pesäkekokoa ja vähentää alkalisen fosfataasin klonaalista ilmentymistä primaariviljelmissä, kun taas hydrokortisonin lisääminen aktivoi alkalisen fosfataasin ilmentymistä, joka on MSC-solujen erilaistumisen osteogeenisen suunnan markkeri. STRO-1:tä vastaan suunnatut monoklonaaliset vasta-aineet mahdollistivat STRO-1-positiivisten adheesiosolujen populaation erottamisen ja tutkimisen heterogeenisessä Dexter-viljelmäjärjestelmässä. On määritetty sytokiinien kirjo, joka säätelee paitsi hematopoieettisten ja lymfoidisolujen lisääntymistä ja erilaistumista, myös osallistuu luustokudosten muodostumiseen, inkorporaatioon ja resorptioon para-, auto- ja endokriinisten mekanismien kautta. Reseptorivälitteistä sellaisten sekundaaristen lähettien kuin cAMP, diasyyliglyseroli, inositolitrifosfaatti ja Ca2+ vapautumista käytetään myös vastaavia reseptoreita ilmentävien stroomakudossolujen eri luokkien markkerianalyysiin. Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö markkereina mahdollisti lymfoidielinten strooman retikulaaristen solujen kuulumisen T- ja B-riippuvaisiin vyöhykkeisiin.

Tieteelliset keskustelut MSC-solujen mahdollisuudesta olla peräisin hematopoieettisista kantasoluista jatkuivat jonkin aikaa. Kun luuydinsolususpensioita siirretään yksikerroksisiin viljelmiin, niissä kasvaa erillisiä fibroblastipesäkkeitä. Osoitettiin kuitenkin, että fibroblastipesäkkeiden esiasteiden ja hematopoieettisten kudosten erilaistumisen versojen esiintyminen luuytimessä ei ole osoitus niiden yhteisestä alkuperästä hematopoieettisista kantasoluista. Luuytimen kantasolujen erotteluanalyysin avulla osoitettiin, että heterotooppisen luuydinsiirron aikana vallitseva mikroympäristö ei siirry hematopoieettisten solujen kautta, mikä todistaa, että luuytimessä on histogeneettisesti hematopoieettisista soluista riippumaton MSC-populaatio.

Lisäksi selektiivinen kloonausmenetelmä mahdollisti uuden strooman progenitorisolujen luokan tunnistamisen luuydinsolujen yksikerroksisissa viljelmissä, niiden lukumäärän määrittämisen sekä niiden ominaisuuksien, proliferaatio- ja erilaistumispotentiaalien tutkimisen. Kävi ilmi, että strooman fibroblastien kaltaiset solut lisääntyvät in vitro ja muodostavat diploidisia pesäkkeitä, jotka takaisin kehoon siirrettyinä mahdollistavat uusien hematopoieettisten elinten muodostumisen. Yksittäisten kloonien tutkimuksen tulokset osoittavat, että strooman progenitorisolujen joukossa on solupopulaatio, joka proliferaatio- ja erilaistumispotentiaalinsa perusteella voi väittää olevansa strooman kudoksen kantasoluja, jotka ovat histogeneettisesti riippumattomia hematopoieettisista kantasoluista. Tämän populaation soluille on ominaista itsestään jatkuva kasvu ja ne erilaistuvat luuytimen luun, ruston ja retikulaarisen kudoksen progenitorisolujen elementeiksi.

Erittäin kiinnostavia ovat R. Chailakhyanin ja hänen yhteistyökumppaneidensa (1997-2001) tutkimusten tulokset, joissa he viljelivät kanien, marsujen ja hiirten luuytimen stromaalisia progenitorisoluja a-MEM-ravintoaineessa, johon oli lisätty vasikan sikiön seerumia. Kirjoittajat suorittivat eksplantaation alkutiheydellä 2-4 x 103 luuydinsolua per 1 cm2. Homologisia tai heterologisia säteilyllä inaktivoituja luuydinsoluja käytettiin annoksena, joka säilytti syöttöaineen vaikutuksen, mutta esti kokonaan niiden lisääntymisen. Kahden viikon ikäisiä primaarisia erillisiä fibroblastipesäkkeitä trypsinoitiin monoklonaalisten kantojen saamiseksi. Todisteet pesäkkeiden klonaalisesta alkuperästä saatiin käyttämällä kromosomimerkkiainetta uros- ja naarasmarsujen sekaviljelmissä, elävien viljelmien aikaviivekuvauksessa ja CBA- ja CBAT6T6-hiirten syngeenisen luuytimen sekaviljelmissä. Tuoreeltaan eristettyjen luuydinsolujen tai in vitro -kasvatettujen stroomafibroblastien suspension siirto munuaiskapselin alle suoritettiin huokoisiin ivalon- tai gelatiinirakenteisiin alustoihin sekä inaktivoituun kaniinin sienimäiseen luumatriisiin. Kloonien siirtoa varten luutuppeen marsun reisiluut puhdistettiin pehmytkudoksesta ja luukalvosta, epifyysit leikattiin pois ja luuydin pestiin huolellisesti. Luu leikattiin palasiksi (3–5 mm), kuivattiin ja säteilytettiin 60 Gy:n annoksella. Yksittäiset fibroblastipesäkkeet asetettiin luutuppeen ja implantoitiin lihaksensisäisesti. In vitro -kasvatettujen stroomafibroblastien vatsaontelonsisäiseen siirtoon käytettiin A-tyypin (V = 0,015 cm3, h = 0,1 mm) ja O-tyypin (V = 0,15 cm3, h = 2 mm) diffuusiokammioita.

Tutkiessaan klonaalisten kantojen kasvudynamiikkaa R. Chailakhyan ym. (2001) havaitsivat, että fibroblastipesäkkeitä muodostavilla yksittäisillä soluilla, samoin kuin niiden jälkeläisillä, on valtava proliferatiivisen potentiaalin. Kymmenenteen jakson loppuun mennessä fibroblastien määrä joissakin kannoissa oli 1,2–7,2 x 109 ^solua. Kehityksensä aikana ne suorittivat jopa 31–34 solun kahdentumista. Tässä tapauksessa useiden kymmenien kloonien stroomaprekursorien muodostamien luuytimestä peräisin olevien kantojen heterotooppinen siirto johti luuytimen mikroympäristön siirtymiseen ja uuden hematopoieettisen elimen muodostumiseen siirtovyöhykkeelle. Kirjoittajat esittivät kysymyksen, kykenevätkö yksittäiset kloonit siirtämään stroomasolujen luuytimen mikroympäristön vai tarvitaanko tähän useiden eri klonogeenisten stroomaprekursorien yhteistyötä? Ja jos yksittäiset kloonit kykenevät siirtämään mikroympäristön, onko se täydellinen kaikille kolmelle hematopoieettiselle itulle, vai tarjoavatko eri kloonit mikroympäristön muodostumisen eri hematopoieettisille ituille? Näiden ongelmien ratkaisemiseksi kehitettiin teknologia strooman progenitorisolujen viljelyyn kollageenigeelillä, jonka avulla kasvaneet fibroblastipesäkkeet voidaan poistaa pinnalta myöhempää heterotooppista siirtoa varten. CBA-hiirten ja -marsujen luuydinsoluista kasvatetut yksittäiset strooman fibroblastien kloonit leikattiin pois yhdessä geelipinnoitteen fragmentin kanssa ja siirrettiin heterotooppisesti - syngeenisten hiirten munuaiskapselin alle tai autologisten marsujen vatsalihakseen. Lihakseen siirrettäessä geelillä olevat pesäkkeet asetettiin luutuppeihin.

Kirjoittajat havaitsivat, että 50–90 päivää luuytimen fibroblastipesäkkeiden siirron jälkeen 20 %:lla tapauksista havaittiin luun tai luu- ja hematopoieettisen kudoksen kehittymistä siirtoalueella. 5 %:lla vastaanottajaeläimistä muodostuneet luukudospesäkkeet sisälsivät luuytimellä täytetyn ontelon. Luulisylinterien sisällä tällaisilla pesäkkeillä oli pyöreä muoto ja luukudoksesta, osteosyyteistä ja hyvin kehittyneestä osteoblastikerroksesta rakennettu kapseli. Luuytimen ontelo sisälsi retikulaarista kudosta, jossa oli myeloidi- ja erytroidisoluja, joiden suhteellinen suhde ei eronnut normaalin luuytimen suhteesta. Munuaisessa siirre oli tyypillinen luuydinelin, joka muodostui natiivin luuytimen siirron aikana, ja luukapseli peitti luuydinontelon vain munuaiskapselin puolelta. Hematopoieettiseen kudokseen kuului myeloidi-, erytroidi- ja megakaryosyyttielementtejä. Luuytimen ontelon stroomassa oli hyvin kehittynyt sinusjärjestelmä ja tyypillisiä rasvasoluja. Samaan aikaan joidenkin pesäkkeiden siirtoalueella munuaiskapselin alla havaittiin luukudosta, jossa ei ollut merkkejä hematopoieesista. Yksittäisten kloonien proliferatiivisten ja erilaistumispotentiaalien tutkimusta jatkettiin kaniinien monoklonaalisilla luuydinkannoilla, joiden solut suspendoitiin uudelleen ravintoalustaan ja erilliseen ivalon-sieneen, joiden massa oli 1-2 mg, ja siirrettiin kaniinin luuydindonorin munuaiskapselin alle. Tällaiseen autotransplantaatioon käytettiin 21 monoklonaalisen kannan soluja. Tulokset otettiin huomioon 2-3 kuukauden kuluttua. Kirjoittajat havaitsivat, että 14 %:ssa tapauksista siirretyt monoklonaaliset kannat muodostivat luuydinelimen, joka koostui luukudoksesta ja hematopoieettisilla soluilla täytetystä luuydinontelosta. 33 %:ssa tapauksista siirretyt kannat muodostivat tiiviin, vaihtelevan kokoisen luun, jonka onteloihin oli upotettu osteosyyttejä ja kehittynyt osteoblastikerros. Joissakin tapauksissa siirrettyihin klooneihin kehittyi retikulaarista kudosta ilman luuta tai hematopoieettisia elementtejä. Joskus muodostui retikulaarista stroomaa, jossa oli hyvin kehittynyt sinusoidien verkosto, mutta se ei ollut hematopoieettisten solujen täyttämä. Saadut tulokset olivat siis samankaltaisia kuin kollageenigeelillä tehdyn kloonisiirron aikana saadut tiedot. Jos substraatille kasvatettujen kloonien siirto kuitenkin johti luuydinkudoksen muodostumiseen 5 %:ssa tapauksista, luukudoksen muodostumiseen 15 %:ssa ja retikulaarikudoksen muodostumiseen 80 %:ssa tapauksista, niin monoklonaalisten kantojen siirrossa luuydinelementtien muodostumista havaittiin 14 %:ssa tapauksista, luukudoksen muodostumista 53 %:ssa ja retikulaarikudoksen muodostumista 53 %:ssa tapauksista. Kirjoittajien mukaan tämä osoittaa, että olosuhteet strooman fibroblastien proliferatiivisen ja erilaistumispotentiaalin toteutumiselle huokoisille alustoille tehtävän siirron aikana olivat optimaaliset kuin niiden siirron aikana luutuppiin ja kollageenisubstraatille.On mahdollista, että kehittyneempien kloonien viljely- ja käänteissiirtomenetelmien käyttö voi parantaa kloonien erilaistumispotentiaalin toteutumisen edellytyksiä ja muuttaa näitä suhteita. Tavalla tai toisella, mutta suoritettujen tutkimusten tärkein merkitys on se, että jotkut stroomasolujen kloonit kykenevät muodostamaan luukudosta ja samanaikaisesti tarjoamaan stroomaa muodostavan hematopoieettisen mikroympäristön kolmelle luuytimen hematopoieesin versolle kerralla: erytroidille, myeloidille ja megakaryosyyttiselle, luoden melko suuria hematopoieettisen kudoksen ja jonkin verran luumassan alustoja.

Kirjoittajat käsittelivät sitten kysymystä yksittäisten klonogeenisten strooman progenitorisolujen kyvystä läpikäydä tämäntyyppisiä soluerilaistumisia suljetussa diffuusiokammiojärjestelmässä. Lisäksi oli tarpeen määrittää, onko yksittäisillä klooneilla polypotenssia vai vaatiiko erilaistumispotentiaalin ilmentyminen useiden kiinteän soluerilaistumisominaisuuden omaavien kloonien yhteistoiminnallista vuorovaikutusta, joiden eri suhteet määräävät ensisijaisesti luu-, retikulaari- tai rustokudoksen muodostumisen. Yhdistämällä kaksi metodologista lähestymistapaa - luuytimen strooman progenitorisolujen monoklonaalisten kantojen hankkimisen ja niiden siirtämisen diffuusiokammioihin - R. Chailakhyan ja kanssakirjoittajat (2001) saivat tuloksia, jotka mahdollistivat heille luuytimen strooman rakenteellisen organisaation ymmärtämisen. Strooman progenitorisolujen monoklonaalisten kantojen siirtäminen O-tyypin kammioihin johti sekä luu- että rustokudoksen muodostumiseen, mikä osoittaa yhden strooman pesäkettä muodostavan solun jälkeläisten kyvyn muodostaa samanaikaisesti luu- ja rustokudosta. Oletus, että luu- ja rustokudos ovat peräisin yhteisestä strooman progenitorisolusta, on esitetty toistuvasti. Tällä hypoteesilla ei kuitenkaan ollut oikeaa kokeellista vahvistusta. Luun ja ruston muodostuminen diffuusiokammioissa oli välttämätön todiste yhteisen kantasolun olemassaolosta näille kahdelle kudostyypille luuytimen strooman kantasolujen joukossa.

Sitten kaniinin luuytimen primaariviljelmistä saadut 29 klonaalista kantaa toisesta ja kolmannesta siirrostuksesta sijoitettiin diffuusiokammioihin ja implantoitiin vatsaontelonsisäisesti homologeihin eläimiin. Tutkimukset osoittivat, että 45 %:lla luuytimen monoklonaalisista kannoista on osteogeenista potentiaalia. Yhdeksän kammiota sisälsi yksinomaan retikulaarista kudosta, mutta sitä oli läsnä yhdessä luu- ja rustokudoksen kanssa 13 muussa kammiossa, jotka muodostivat 76 % kaikista kannoista. Tyypin O kammioissa, joissa sekä luu- että rustokudoksen erilaistuminen oli mahdollista, tutkittiin 16 kantaa. Neljässä kammiossa (25 %) muodostui sekä luu- että rustokudosta. On jälleen huomioitava, että R. Chailakhyan ym. (2001) tutkimuksissa yksittäiset progenitorisolut läpikäyivät 31–34 kahdentumista solukannan sisällä, ja niiden jälkeläiset koostuivat 0,9–2,0 x 109 ^solusta. Polyklonaalisten kantojen progenitorisolujen läpikäymien mitoosien määrä oli käytännössä identtinen monoklonaalisten kantojen kanssa. Polyklonaalisten kantojen kehitysnopeus, erityisesti niiden muodostumisen ensimmäisessä vaiheessa, riippui merkittävästi kantojen aloittamiseen käytettyjen pesäkkeiden lukumäärästä. Myös ihmisalkion fibroblastien diploidit kannat (WI-38), kun niitä kloonattiin uudelleen 12.–15. kahdentumistasolla, muodostivat pesäkkeitä, jotka vaihtelivat halkaisijan ja solupitoisuuden suhteen. Suuret, yli 103 solua sisältävät pesäkkeet muodostivat vain 5–10 %. Jakautumisten määrän kasvaessa suurten pesäkkeiden prosenttiosuus väheni. Luuytimen strooman fibroblastien mono- ja polyklonaaliset kannat säilyttivät diploidisen kromosomiston 20 tai useamman kahdentumisen jälkeen, ja niiden kehityssuuntaus oli verrattavissa alkion fibroblastien diploidisten kantojen kehitysdynamiikkaan. Yksittäisten luuytimen strooman progenitorisolujen erilaistumispotentiaalin analyysi, joka suoritettiin siirtämällä monoklonaalisia kantoja diffuusiokammioihin, osoitti, että puolet niistä oli osteogeenisiä. Suuret pesäkkeet muodostivat 10 % niiden kokonaismäärästä. Näin ollen osteogeenisten pesäkkeitä muodostavien solujen määrä vastasi noin 5 % niiden kokonaispopulaatiosta. Kirjoittajien tunnistamien osteogeenisten progenitorisolujen kokonaismassa sisälsi soluja, jotka kykenivät samanaikaisesti muodostamaan luu- ja rustokudosta. Lisäksi ensimmäistä kertaa osoitettiin, että näillä kahdella kudostyypillä aikuisen organismissa on yhteinen progenitorisolu: 25 % testatuista klooneista oli tällaisten solujen luomia, ja niiden osuus progenitorisolujen kokonaispopulaatiosta oli vähintään 2,5 %.

Siten luuytimen fibroblastien yksittäisten kloonien heterotooppinen siirto on paljastanut uusia näkökohtia mesenkymaalisten progenitorisolujen populaation rakenteellisessa organisaatiossa. On löydetty stromaalisia progenitorisoluja, jotka kykenevät siirtämään tietyn mikroympäristön kaikille hematopoieettisille versoille kerralla, ja joiden määrä eri malleissa tutkittujen suurten kloonien joukossa vaihtelee 5-15%:n välillä (0,5-1,5% havaittujen progenitorisolujen kokonaismäärästä). Täydellisen luuytimen mikroympäristön siirtävien kloonien ohella on vain osteogeneesille ominaisia progenitorisoluja, jotka avoimessa järjestelmässä siirrettäessä muodostavat luukudosta, joka ei tue hematopoieesin kehittymistä. Niiden määrä progenitorisolujen kokonaismäärästä on 1,5-3%. Jotkut näistä soluista kykenevät muodostamaan luukudosta rajoitetulla itsehoitoajalla. Näin ollen stromaalisten progenitorisolujen populaatio on heterogeeninen erilaistumispotentiaaliltaan. Niiden joukossa on soluluokka, jotka väittävät olevansa stromaalisia kantasoluja ja kykenevät erilaistumaan kaikkiin kolmeen luuytimen stroomatudolle tyypilliseen suuntaan muodostaen luuta, rustoa ja retikulaarista kudosta. Esitetyt tiedot antavat meille toivoa, että erilaisia solumarkkereita käyttämällä on mahdollista määrittää kunkin stroomasolujen tyypin vaikutus tietyn mikroympäristön organisointiin ja hematopoieesin tukemiseen Dexter-viljelmissä.

Mesenkymaalisten kantasolujen ominaisuudet

Viime vuosina on todettu, että kiinteissä luuydinviljelmissä multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja edustaa rajallinen populaatio pieniä agranulaarisia soluja (RS-1-soluja), joille on ominaista heikko pesäkkeidenmuodostuskyky ja lisääntyville soluille spesifisen Ki-67-antigeenin ilmentymisen puuttuminen. Lepotilassa olevien RS-1-solujen antigeeniset parametrit eroavat nopeasti lisääntyvien sitoutuneiden stromaalisten progenitorisolujen antigeenien spektristä. On todettu, että sitoutuneiden progenitorisolujen korkea lisääntymisnopeus havaitaan vain RS-1-solujen läsnä ollessa. RS-1-solut puolestaan lisäävät kasvuvauhtiaan multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen kypsimpien johdannaisten erittämien tekijöiden vaikutuksesta. Näyttää siltä, että RS-1-solut ovat alaluokka sitoutumattomia MSC-soluja, jotka kykenevät kierrätykseen. In vitro 5-fluorourasiilille resistenteille luuytimen stromaalisille progenitorisoluille on ominaista alhainen RNA-pitoisuus ja ornitiinidekarboksylaasigeenin, ei-lisääntyvien solujen markkerin, korkea ilmentyminen.

Strooman progenitorisolujen intensiivinen lisääntyminen alkaa niiden kiinnittymisen jälkeen substraattiin. Tässä tapauksessa ilmentyvät huonosti erilaistuneiden solujen markkeriprofiili: SH2 (TGF-(3)-reseptori), SH3 (signalointiproteiinidomeeni), kollageenityypit I ja III, fibronektiini, adheesioreseptorit VCAM-1 (CD106) ja ICAM (CD54), kadheriini-11, CD44, CD71 (transferriinireseptori), CD90, CD120a ja CD124, mutta ilman hematopoieettisten kantasolujen tyypillisten markkereiden (CD34, CD14, CD45) ilmentymistä. Klonaalinen kasvu mahdollistaa mesenkymaalisten kantasolujen toistuvan siirroksen, jolloin muodostuu lukuisia geneettisesti homogeenisia strooman progenitori-pluripotentteja soluja viljelmässä. 2-3 siirroksen jälkeen niiden lukumäärä saavuttaa 50-300 miljoonaa. Riittävän tiheässä viljelmässä, lisääntymisen pysähtymisen jälkeen, strooman progenitorisolut, toisin kuin hematopoieettisen kudoksen fibroblastit, erilaistuvat adiposyyteiksi, lihas-, rusto- ja luusoluiksi. Kolmen säätelyyn liittyvän erilaistumissignaalin yhdistelmä, mukaan lukien 1-metyyli-isobutyyliksantiini (solunsisäisen cAMP:n muodostumisen indusoija), deksametasoni (fosfolipaasien A ja C estäjä) ja indometasiini (syklo-oksigenaasin estäjä, joka myös vähentää tromboksaanisyntaasin aktiivisuutta), muuntaa jopa 95 % mesenkymaalisista progenitorisoluista adiposyyteiksi. Adiposyyttien muodostuminen epäkypsistä strooman elementeistä vahvistetaan lipoproteiinilipaasigeenin ilmentymisellä, apolipoproteiinien ja peroksisomaalisten reseptorien histokemiallisella havaitsemisella. Saman kloonin solut TGF-b:n vaikutuksen alaisena seerumittomassa väliaineessa muodostavat homogeenisen kondrosyyttipopulaation. Tämän rustokudoksen monikerroksiselle soluviljelmälle on ominaista kehittynyt solujen välinen matriisi, joka koostuu proteoglykaanista ja tyypin II kollageenista. Ravintoaineessa, jossa on 10 % β-glyserofosfaatista (epäorgaaninen fosfaatin luovuttaja), askorbiinihaposta ja deksametasonista koostuvan erilaistumissignaalikompleksin vaikutus samaan strooman progenitorisolujen viljelmään johtaa soluaggregaattien muodostumiseen. Tällaisissa soluissa havaitaan alkalisen fosfataasiaktiivisuuden ja osteopontiinitasojen asteittaista kasvua, mikä osoittaa luukudoksen muodostumista, jonka solujen mineralisaatiota vahvistaa solunsisäisen kalsiumpitoisuuden asteittainen kasvu.

Joidenkin tietojen mukaan mesenkymaalisten kantasolujen kyky jakautua ja lisääntyä rajattomasti erityyppisissä mesenkymaalisessa erilaistumislinjassa yhdistyy korkeaan plastisuuteen. Kun mesenkymaalisia kantasoluja viedään aivojen kammioihin tai valkeaan aineeseen, ne siirtyvät hermokudoksen parenkyymiin ja erilaistuvat glia- tai hermosolulinjan johdannaisiksi. Lisäksi on tietoa MSC-solujen transdifferentiaatiosta hematopoieettisiksi kantasoluiksi sekä in vitro että in vivo. Perusteellisempi analyysi joissakin tutkimuksissa on osoittanut MSC-solujen poikkeuksellisen korkean plastisuuden, joka ilmenee niiden kyvyssä erilaistua astrosyyteiksi, oligodendrosyyteiksi, neuroneiksi, sydänlihassoluiksi, sileän lihaksen soluiksi ja luustolihassoluiksi. Useat MSC-solujen transdifferentiaatiopotentiaalia in vitro ja in vivo koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että luuytimestä peräisin olevat multipotentit mesenkymaaliset progenitorisolut erilaistuvat terminaalisesti solulinjoiksi, jotka muodostavat luu-, rusto-, lihas-, hermo- ja rasvakudosta sekä jänteitä ja stroomaa, jotka tukevat hematopoieesia.

Muissa tutkimuksissa ei kuitenkaan havaittu merkkejä mesenkymaalisten kantasolujen genomin ja strooman solujen progenitoripopulaatioiden pluripotenssin rajoittumisesta, vaikka yli 200:aa yhdestä primaariviljelmästä eristettyä MSC-kloonia tutkittiin strooman solujen mahdollisen pluripotenssin testaamiseksi. Ylivoimaisesti suurin osa klooneista in vitro säilytti kyvyn erilaistua osteogeeniseen, rusto- ja rasvakudosrakenteeseen. Kun suljettiin pois vastaanottajasolujen migraation todennäköisyys siirtämällä mesenkymaalisia kantasoluja munuaiskapselin alle tai diffuusiokammioihin, kävi ilmi, että strooman progenitorisolut in situ säilyttävät heterogeenisen fenotyypin, mikä osoittaa joko restriktiotekijöiden puuttumisen siirtovyöhykkeellä tai MSC-pluripotenssin puuttumisen sinänsä. Samalla sallitaan harvinaisen somaattisten pluripotenttien kantasolujen olemassaolo, jotka ovat kaikkien aikuisten kantasolujen yleisiä esiasteita.

Todellisten mesenkymaalisten kantasolujen multipotenssi, mutta ei pluripotenssi, muodostaa hyvin pienen osan luuydinsoluista ja kykenee lisääntymään tietyissä olosuhteissa in vitro -viljelyn aikana erilaistumatta. Tämä ilmenee niiden indusoituna sitoutumisena luu-, rusto-, rasva- ja lihaskudossoluihin sekä tenosyytteihin ja strooman elementteihin, jotka tukevat hematopoieesia. Yleensä pitkäaikainen altistuminen sikiön vasikan seerumia sisältävälle viljelyalustalle provosoi mesenkymaalisia kantasoluja (MSC), jotka vapautuvat sitoutuneiksi strooman progenitorisoluiksi, joiden jälkeläiset käyvät läpi spontaanin terminaalisen erilaistumisen. In vitro -olosuhteissa on mahdollista saavuttaa kohdennettu osteoblastien muodostuminen lisäämällä deksametasonia, ß-glyserofosfaattia ja askorbiinihappoa hoitoalustaan, kun taas deksametasonin ja insuliinin erilaistumissignaalien yhdistelmä indusoi adiposyyttien muodostumista.

On todettu, että ennen terminaalisen erilaistumisen vaiheeseen siirtymistä luuytimen MSC:t erilaistuvat aluksi fibroblastien kaltaisiksi mesenkymaalisiksi kantasoluiksi tietyissä viljelyolosuhteissa. Näiden solujen johdannaiset osallistuvat in vivo luiden, ruston, jänteiden, rasva- ja lihaskudoksen sekä hematopoieesia tukevan strooman muodostumiseen. Monet kirjoittajat ymmärtävät termin "multipotentit mesenkymaaliset kantasolut" tarkoittavan sekä itse MSC:itä että luuytimen ja mesenkymaalisten kudosten sitoutuneita stroomasoluja. Luuytimestä peräisin olevien multipotenttien mesenkymaalisten kantasolujen kloonianalyysi osoitti, että hieman yli kolmasosa kaikista klooneista erilaistuu osteo-, kondro- ja adiposyyteiksi, kun taas jäljellä olevien kloonien soluilla on vain osteogeeninen potentiaali ja ne muodostavat vain kondro- ja osteosyyttejä. Multipotenttien mesenkymaalisten kantasolujen, kuten BMC-9:n, klooni erilaistuu sopivissa mikroympäristöolosuhteissa soluiksi, joilla on paitsi osteoblastien, kondrosyyttien ja adiposyyttien, myös hematopoieesia tukevien stroomasolujen fenotyyppi ja toiminnalliset ominaisuudet. Rotan sikiön luuytimestä eristetty RCJ3.1-solujen klooni erilaistuu eri fenotyyppisiksi mesenkymaalisiksi soluiksi. Askorbiinihapon, b-glyserofosfaatin ja deksametasonin yhteisvaikutuksesta tämän kloonin soluelementit muodostavat ensin monitumaisia myosyyttejä ja sitten peräkkäin adiposyyttejä, kondrosyyttejä ja mineralisoituneen luukudoksen saarekkeita. Rotan sikiöiden luukalvosta peräisin olevien rakeisten solujen populaatio vastaa sitoutumattomia multipotentteja mesenkymaalisia progenitorisoluja, koska sille on ominaista alhainen lisääntymisnopeus, se ei ilmennä erilaistumismerkkejä ja viljelyolosuhteissa erilaistuu kondro-, osteo- ja adiposyyteiksi sekä sileiksi lihassoluiksi.

Näin ollen on tunnustettava, että mesenkymaalisten kantasolujen genomin pluri- tai multipotenssikysymys on edelleen avoin, mikä vaikuttaa vastaavasti myös käsityksiin stromaalisten progenitorisolujen erilaistumispotentiaalista, jota ei myöskään ole lopullisesti vahvistettu.

Mesenkymaalisten kantasolujen kokeellisesti todistettu ja tärkeä ominaisuus on niiden kyky poistua kudoslokerosta ja kiertää yleisessä verenkierrossa. Geneettisen erilaistumisohjelman aktivoimiseksi tällaisten verenkierrossa olevien kantasolujen on päästävä sopivaan mikroympäristöön. On osoitettu, että kun MSC-soluja viedään systemaattisesti vastaanottajaeläinten verenkiertoon, epäkypsiä soluja istutetaan eri elimiin ja kudoksiin, ja ne erilaistuvat sitten verisoluiksi, myosyyteiksi, adiposyyteiksi, kondrosyyteiksi ja fibroblasteiksi. Tämän seurauksena paikallisissa kudosvyöhykkeissä tapahtuu signaali-säätelyvuorovaikutuksia sitoutumattomien ja sitoutuneiden stromaalisten progenitorisolujen sekä niiden ja ympäröivien kypsien solujen välillä. Oletetaan, että erilaistumisen indusoivat mesenkymaalisten ja ei-mesenkymaalisten alkuperää olevat parakriiniset säätelytekijät (kasvutekijät, eikosanoidit, solunulkoiset matriisimolekyylit), jotka tarjoavat spatiaalisia ja ajallisia yhteyksiä multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen mikroympäristössä. Siksi mesenkymaalisten kudosten paikallisten vaurioiden tulisi johtaa multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen mikroympäristön vyöhykkeiden muodostumiseen, jotka ovat kvalitatiivisesti erilaisia kuin ehjien kudosten säätelysignaalien kompleksi, jossa tapahtuu fysiologisia eikä korjaavia regeneraatioprosesseja. Tämä ero on erittäin tärkeä solufenotyypin erikoistumisen kannalta normaalissa ja vaurioiden aiheuttamassa mikroympäristössä.

Käsitteiden mukaan juuri tässä juurtuvat kahden tunnetun prosessin - fysiologisen regeneraation ja tulehduksellisen proliferaation - perustavanlaatuisen eron mekanismit. Ensimmäinen niistä päättyy kudoksen erikoistuneen solukoostumuksen ja sen toiminnan palautumiseen, kun taas proliferaatioprosessin toteutumisen tuloksena on kypsien sidekudoselementtien muodostuminen ja vaurioituneen kudosalueen toiminnan menetys. Siksi optimaalisten ohjelmien kehittämiseksi multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen käyttöön regeneratiivisessa-plastisessa lääketieteessä on tarpeen tutkia perusteellisesti mikroympäristötekijöiden vaikutusta MSC-solujen erilaistumiseen.

Kantasoluosaston rakenteen riippuvuus solujen para- ja autokriinisistä säätelijöistä, joiden ilmentymistä ulkoiset signaalit säätelevät, on kiistaton. Säätelytekijöiden toiminnoista tärkeimpiä ovat MSC-solujen epäsymmetrisen jakautumisen säätely ja sitoutumisvaiheita ja solujakautumisten määrää määrittävien geenien ilmentyminen. Ulkoiset signaalit, joista MSC-solujen jatkokehitys riippuu, saadaan niiden mikroympäristöstä. Epäkypsässä tilassa MSC-solut lisääntyvät pitkään säilyttäen kyvyn erilaistua adiposyyttien, myofibroblastien, hematogeenisen kudosstrooman, rusto- ja luusolujen linjoiksi. On osoitettu, että rajallinen määrä veressä kiertäviä CD34-negatiivisia strooman soluelementtejä palaa yleisestä verenkierrosta luuytimen stroomaan, jossa ne muuntuvat CD34-positiivisiksi hematopoieettisiksi kantasoluiksi. Nämä havainnot viittaavat siihen, että mesenkymaalisten progenitorisolujen takaisinkierto verenkiertoon ylläpitää strooman kantasolujen kudostasapainoa eri elimissä mobilisoimalla luuytimen yhteisen epäkypsien strooman elementtien poolin. Mesenkymaalisten kantasolujen (MSC) erilaistuminen soluiksi, joilla on useita mesenkymaalisia fenotyyppejä, ja niiden osallistuminen luun, ruston, rasvakudoksen ja jänteiden uudistamiseen tai korjaamiseen in vivo on osoitettu käyttämällä adoptiivisia siirtomalleja koe-eläimillä. Muiden kirjoittajien mukaan MSC-solujen etäinen kulkeutuminen verisuonistoa pitkin yhdistyy multipotenttien mesenkymaalisten kantasolujen lyhyen matkan tai paikalliseen liikkumiseen kudoksessa ruston korjauksen, lihasten uudistumisen ja muiden korjaavien prosessien aikana.

Strooman kudospohjan paikalliset kantasoluvarastot toimivat solujen lähteenä fysiologisessa kudosregeneraatiossa, ja niitä täydennetään mesenkymaalisten solujen (MSC) kaukaisella kuljetuksella, kun strooman kudospohjan varsiresursseja kulutetaan. Kuitenkin olosuhteissa, joissa korjaavan solupotentiaalin mobilisointi on tarpeen hätätilanteessa, esimerkiksi polytrauman sattuessa, koko MSC-solujen verkosto osallistuu korjaavan regeneraation prosesseihin, ja luuytimen mesenkymaaliset progenitorisolut rekrytoidaan perifeerisille alueille yleisen verenkierron kautta.

Mesenkymaalisten kantasolujen siirto

Fysiologisen kudosregeneraation prosessien ja niiden muodostumisen välillä kohdunsisäisen kehityksen aikana voidaan havaita tiettyjä yhtäläisyyksiä. Ihmisen ja nisäkkäiden alkionkehityksessä erityyppisten erikoistuneiden solujen muodostuminen tapahtuu alkiosolujen ekto-, meso- ja endodermaalivarastosta, mutta mesenkyymin osallistuminen on pakollista. Alkion mesenkyymikudoksen löyhä soluverkosto suorittaa lukuisia säätely-, aineenvaihdunta-, runko- ja morfogeneettisiä toimintoja. Väliaikaisten elinten muodostuminen tapahtuu vasta mesenkyymin tiivistymisen jälkeen progenitorisolujen klonogeenisen kasvun ansiosta, jotka tuottavat organogeneesin ensisijaiset morfogeneettiset signaalit. Alkion mesenkyymin stroomajohdannaiset luovat väliaikaisten elinten solurungon ja muodostavat perustan niiden tulevalle energia-plastiselle toiminnalle primaaristen veri- ja imusuonten kasvun ansiosta. Toisin sanoen sikiöelinten mikrokiertoyksikön stroomaelementit syntyvät ennen niiden rakenteellisten ja toiminnallisten yksiköiden muodostumista. Lisäksi mesenkyymisolujen aktiivinen migraatio organogeneesin aikana tarjoaa kehittyville elimille spatiaalisen orientaation merkitsemällä niiden tilavuusrajat homeoottisten Hox-tyyppien rajoittumisen kautta. Strooman runko toimii myös perustana parenkymaalisten elinten rakenteellisten ja toiminnallisten yksiköiden kokoamiselle, jotka usein sisältävät morfogeneettisesti ja toiminnallisesti täysin erilaisia soluja. Näin ollen alkionkehityksen aikana mesenkyymin toiminnot ovat primaarisia ja toteutuvat säätelysignaalien tuottamisen kautta, jotka aktivoivat epiteelisolujen alueellista proliferaatiota ja erilaistumista. Alkion mesenkyymisolut tuottavat kasvutekijöitä, kuten HGF-b, HGF-b, CSF, joille parenkyymisoluilla on vastaavat reseptorit. Aikuisen organismin erilaistuneessa kypsässä kudoksessa strooman soluverkosto tuottaa myös signaaleja ei-mesenkymaalista alkuperää olevien progenitorisolujen elinkelpoisuuden ja proliferaation ylläpitämiseksi. Postnataalisessa ontogeneesissä strooman säätelysignaalien spektri on kuitenkin erilainen (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF jne.) ja sen tarkoituksena on varmistaa vaurioituneiden kudosalueiden fysiologinen uudistuminen tai korjaus. Lisäksi strooman säätelytekijöiden spektraaliset ominaisuudet vaihtelevat kussakin kudostyypissä ja jopa saman elimen sisällä. Erityisesti hematopoieesi ja lymfopoieesi, johon liittyy hematopoieettisten ja immunokompetenttien solujen lisääntymistä ja erilaistumista, tapahtuvat vain tietyissä elimissä, joiden rajoissa strooman mikroympäristö toimii ja tarjoaa edellytykset hematopoieettisten ja lymfoidisolujen kypsymiselle. Hematopoieettisten ja lymfoidisolujen kyky uudelleenasuttaa tietty elin, lisääntyä ja kypsyä sen mikrorakenteellisissa lokeroissa riippuu mikroympäristön säätelytekijöistä.

Multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen tuottamista solunulkoisen matriisin komponenteista on huomattava fibronektiini, laminiini, kollageeni ja proteoglykaanit sekä CD44 (hyaluronaani- ja osteopontiinireseptori), joilla on merkittävä rooli solujen välisten vuorovaikutusten järjestämisessä ja solunulkoisen matriisin muodostamisessa luuytimessä ja luukudoksessa. On osoitettu, että luuytimen multipotentit mesenkymaaliset progenitorisolut luovat strooman mikroympäristön, joka tarjoaa induktiivisia ja säätelysignaaleja paitsi MSC-soluille, myös hematopoieesille ja muille luuytimen ei-mesenkymaalisille kantasoluille. Tiedetään, että MSC-solujen osallistuminen hematopoieesiin määräytyy niiden kyvyn perusteella erilaistua hematopoieesia tukeviksi strooman soluiksi, ja MSC-solut vastaanottavat tämän ohjeellisen signaalin suoraan hematopoieesista kantasoluista. Tästä syystä strooman progenitorisolujen verkosto toimii viljelmässä kaikkien hematopoieesisolujen kloonien kehityksen tukikohtana.

Kypsässä organismissa hemo- ja lymfopoieesin intensiteetti on dynaamisessa tasapainossa kypsien verisolujen ja immuunijärjestelmän solujen "kulutuksen" kanssa periferialla. Koska luuytimen ja lymfoidisten elinten stroomasolut uusiutuvat erittäin harvoin, niissä ei tapahdu merkittävää stroomarakenteiden uudelleenjärjestelyä. Järjestelmä voidaan poistaa dynaamisesta tasapainosta mekaanisilla vaurioilla mihin tahansa hemo- tai lymfopoieesielimeen, mikä johtaa tasaisiin peräkkäisiin muutoksiin, jotka koskevat paitsi hematopoieettisia tai lymfoidisia elementtejä, myös vaurioituneen elimen stroomarakenteita. Reparatiivisen regeneraation prosessissa muodostuu ensin stroomapohja, joka sitten täyttyy uudelleen hematopoieettisilla tai immunokompetenteilla soluilla. Tämä pitkään tunnettu tosiasia tekee traumaperäisestä regeneraatiosta kätevän mallin hematopoieettisten elinten stroomamikroympäristön tutkimiseen. Erityisesti putkimaisten luiden medullaarisen ontelon mekaanista tyhjennystä käytetään luuytimen reparatiivisen regeneraation tutkimiseen - kuretaasi, joka mahdollistaa hematopoieettisen kudoksen nopean ja tehokkaan poistamisen dynaamisen tasapainon tilasta. Tutkittaessa luuytimen hematopoieettisten ja stroomasolujen korjaavan uudistumisen prosesseja marsujen sääriluun ydinontelon mekaanisen tyhjennyksen jälkeen havaittiin, ettei hematopoieettisten ja stroomasolujen uudistumisindikaattoreiden (hematopoieettisten solujen lukumäärä, stroomasolujen progenitorisolujen pitoisuus ja lukumäärä) välillä ole suoraa korrelaatiota. Lisäksi kävi ilmi, että stroomasolujen progenitorisolujen populaation kasvu tapahtuu aikaisemmin kaavinnan jälkeen, ja stroomafibroblastit itsessään tulevat fosfataasipositiivisiksi, mikä on tyypillistä osteogeeniselle kudokselle. On myös todettu, että 3-5 putkiluun kaavinta johtaa tämän solupopulaation kasvuun ei-operoitujen luiden luuytimessä ja jopa pernassa, joka marsuilla on yksinomaan lymfopoieettinen elin.

Marsujen kuretoitujen sääriluiden luuytimen korjausprosessien morfologinen kuva vastaa yleisesti ottaen kirjallisuudessa kuvattuja tietoja, jotka on saatu muilla lajeilla tehdyistä eläinkokeista, ja hematopoieettisen kudoksen poistamisen jälkeisten muutosten dynamiikka on sama kaikilla eläinlajeilla ja ero koskee vain aikaparametreja. Morfologisesti hematopoieesin palautumisen vaihejärjestys tyhjennetyssä medullaarisessa ontelossa koostuu peräkkäisistä prosesseista: verihyytymän organisoitumisesta, karkean sidekudoksen luukudoksen muodostumisesta, sen imeytymisestä, sinusoidien kehittymisestä ja retikulaarisen strooman muodostumisesta, joka myöhemmin täyttyy hematopoieettisilla elementeillä. Tässä tapauksessa hematopoieettisten kantasolujen määrä luuytimen kudoksen uudistumisprosessissa kasvaa samanaikaisesti hematopoieettisten kantasolujen määrän kasvun kanssa.

Yu. Gerasimov ja yhteistyökumppanit (2001) vertasivat hematopoieettisten solujen ja strooman progenitorisolujen lukumäärän muutoksia regeneraatioprosessin yksittäisissä vaiheissa. Kävi ilmi, että luuydinsolujen määrälliset muutokset kuretoidussa luussa vastaavat regeneraation morfologisten ominaisuuksien dynamiikkaa. Kirjoittajat yhdistävät regeneraatin solupitoisuuden vähenemisen ensimmäisten kolmen päivän aikana hematopoieettisten solujen kuolemaan, joka johtuu proliferoituvan retikulaarisen kudoksen luoman mikroympäristön epäsuotuisasta vaikutuksesta säilyneessä luuytimessä epifyysialueella, sekä osteoidikudosfokusten muodostumiseen jälkimmäisessä ja verisuonivaurioihin kuretoinnin aikana. 7.-12. päivänä tumallisten solujen määrän nousu osuu yhteen myeloidisen hematopoieesin yksittäisten fokusten ilmestymisen kanssa strooman elementtien proliferaatiovyöhykkeille. 20. päivänä ilmestyy merkittäviä regeneroituneen luuytimen alueita ja hyvin kehittyneitä poskionteloita, joihin liittyy merkittävä solujen kokonaismäärän kasvu. Hematopoieettisten elementtien määrä tänä aikana on kuitenkin 68 % kontrollitasosta. Tämä on yhdenmukaista aiemmin julkaistujen tietojen kanssa, joiden mukaan hematopoieettisten solujen määrä kaavinnan jälkeen saavuttaa normin vasta 35.–40. päivänä leikkauksen jälkeen.

Varhaisessa traumaperäisessä vaiheessa hematopoieesin palautumisen tärkein lähde ovat kaavinnan aikana säilyneet paikalliset soluelementit. Myöhemmissä vaiheissa luuytimen hematopoieettisen kudoksen uudistumisen tärkein lähde ovat kantasolut, jotka täydentävät vapaita strooman vyöhykkeitä. Yksittäisten strooman solujen luokkien (endoteeli-, retikulaari- ja osteogeeniset) osalta lähteet, jotka varmistavat niiden muodostumisen luuytimen ontelon uudelleenjärjestelyn aikana, ovat edelleen epäselviä. Yu. V. Gerasimovin ja yhteistyökumppaneiden (2001) tutkimuksen tulokset osoittavat, että kaavinnan jälkeen säilyneessä luuytimessä fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen pitoisuus on merkittävästi suurempi kuin normaalissa luuytimessä. Kirjoittajat uskovat, että kaavinta johtaa hematopoieettisten solujen intensiivisempään selektiiviseen huuhtoutumiseen verrattuna pesäkkeitä muodostaviin strooman soluihin, jotka osallistuvat strooman muodostumiseen ja ovat vahvemmin yhteydessä sen pääaineeseen kuin hematopoieettiset solut.

Fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen lukumäärän muutoksen dynamiikka korreloi osteogeneesin prosessien voimakkuuden, sitä seuraavan luutrabekuloiden resorption ja retikulaarisen strooman muodostumisen kanssa, jota hematopoieesisolut täyttävät. Suurin osa strooman progenitorisoluista muodostaa regeneraation määritellyissä vaiheissa karkeaa sidekudosluukudosta ja retikulaarista stroomaa. Reisiluun murtumien yhteydessä pitkittyneen osteosynteesin olosuhteissa fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen pitoisuus ja lukumäärä regeneraatioalueella kasvaa viidentenä päivänä, ja intensiivisen luunmuodostuksen aikana niiden lukumäärä kasvaa kuusinkertaiseksi. Tiedetään, että fibroblastipesäkkeitä muodostavilla luuydinsoluilla on osteogeenisiä ominaisuuksia. Strooman progenitorisolujen määrä kasvaa ennen kuin hematopoieesisolut asettuvat kuretoituneelle luuydinalueelle. Tämä on sopusoinnussa sen tiedon kanssa, että stroomasolut muodostavat hematopoieesimikroympäristön. Ilmeisesti hematopoieesimikroympäristön syntyminen vastaa tiettyä strooman kudoksen uudistumisen tasoa, ja hematopoieesisolujen määrä kasvaa hematopoieesiin soveltuvan strooman alustan laajentuessa.

Mielenkiintoisimpia ovat kirjoittajien tiedot, joiden mukaan välittömästi kaavinnan jälkeen strooman progenitorisolujen määrä luuston syrjäisissä osissa kasvaa. Kuudennesta tunnista kahdenteenkymmenenteen päivään asti havaitaan yli kaksinkertainen kasvu sekä fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen pitoisuudessa että lukumäärässä kontralateraalisessa sääriluussa. Tämän ilmiön mekanismi liittyy todennäköisesti siihen, että massiivinen luuydinvaurio johtaa suuren määrän verihyytymien muodostumiseen, samalla kun merkittävä määrä verihiutaleita tuhoutuu ja verihiutalekasvutekijää (PDGF) vapautuu vereen, minkä tiedetään aiheuttavan fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen lisääntymistä kehossa proliferatiivisen poolin ulkopuolella. Kaneilla tehdyissä kokeissa MSC-solujen paikallinen anto edistää kirurgisesti vaurioituneen polvinivelen rustokudoksen palautumista, mikä voi liittyä injektoiduista MSC-soluista peräisin olevien kondrosyyttien muodostumiseen. Laboratoriorotilla luuvaurioiden korjaava uudistuminen tehostuu kuitenkin merkittävästi käyttämällä keraamiseen kehykseen suljettuja mesenkymaalisia kantasoluja. Siksi voidaan olettaa, että ellei RBOC, niin jokin muu vaurioituneista stroomasoluista peräisin oleva tekijä vaikuttaa etäisesti mesenkymaalisten progenitorisolujen lisääntymiseen ehjillä luuydinalueilla ja stimuloi niiden migraatiota luuydinvaurioalueelle. Tämän puolestaan kumoavat aiempien vuosien kirjallisuustiedot, jotka osoittavat, että mikroympäristöstä vastaavat stroomasolut, toisin kuin hematopoieettiset solut, eivät kykene migroitumaan ja ovat peräisin paikallisista lähteistä.

Yu. Gerasimovin ja hänen yhteistyökumppaneidensa (2001) tutkimuksen tulokset kuitenkin osoittavat, että mekaaninen trauma aiheuttaa paitsi kuretoidun luun strooman jyrkän uudelleenjärjestelyn, myös merkittäviä muutoksia stroomassa kaukaisissa ehjissä luissa, eli strooman kudoksessa on systeeminen vaste paikalliseen traumaan. Lisäksi polytrauman - moninkertaisen kuretoinnin - yhteydessä tämä reaktio voimistuu ja sitä havaitaan paitsi leikatussa luussa ja luuston kaukaisissa osissa, myös imukudoksissa, erityisesti pernassa. Tällaisen luuytimen ja pernan strooman kudoksen systeemisen vasteen mekanismi paikalliseen traumaan ja polytraumaan on edelleen tuntematon. Oletetaan, että tämä prosessi liittyy luuytimen medullaarisen ontelon mesenkymaalisen strooman erittämän humoraalisen tekijän toimintaan. Luuytimen ja pernan strooman solujen mahdollisuus tuottaa elinspesifistä humoraalista tekijää, joka vastaa fibroblastipesäkkeitä muodostavien solujen lisääntymisestä, on osoitettu tiedoilla niiden pesäkkeitä stimuloivasta aktiivisuudesta luuytimen yksikerroksisissa viljelmissä.

Tässä suhteessa on syytä huomata, että multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen systeemisen annon yhteydessä niiden johdannaiset repopuloivat paitsi luuytimen, myös muita kudoksia, mitä käytetään erityisesti geeniterapiassa. On osoitettu, että kun kollageeni I -geenin mutaatiossa oleville hiirille annetaan laskimonsisäisesti suuria määriä villityypin genomin omaavia MSC-soluja, luovuttajasolut korvaavat jopa 30 % vastaanottajien luu- ja rustokudoksen soluista, ja transfektoidut hiiren mesenkymaaliset kantasolut, jotka erittävät ihmisen IL-3:a, tukevat tehokkaasti hematopoieesia 9 kuukauden ajan, jos niitä annetaan samanaikaisesti ihmisen hematopoieettisten kantasolujen kanssa immuunipuutteisille hiirille.

[ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]

Mesenkymaalisten kantasolujen geneettinen modifikaatio

MSC-solujen kokeellisen geneettisen modifikaation onnistumisista on mainittava tekijä IX -geenin transfektio ihmisen MSC-soluihin ja sen jälkeen transfektanttisolujen siirto immuunipuutteisille hiirille, mikä johtaa antihemofiilisen tekijä B:n esiintymiseen veressä 8 viikon ajan siirron jälkeen. Tässä kokeessa transfektoiduissa soluissa suoritettiin tekijä IX:n translaation jälkeinen modifikaatio y-glutamyylikarboksylaasilla. MSC-solujen transduktio ihmisen tekijä IX:ää koodaavalla retrovirusvektorilla oli vähemmän onnistunutta - näiden solujen myöhempi anto hemofilia B:tä sairastavalle koiralle tarjosi tekijä IX:n terapeuttisen tason, joka ylläpiti normaalia hyytymishemostaasin voimakkuutta vain 12 päivän ajan.

Mesenkymaalisten kantasolujen siirto eläinten aivojen parenkyymiin on osoittanut, että luovuttajien kehittymättömät solut muuntuvat sekä hermosolu- että gliasolupopulaatioiksi. Terveen luovuttajan mesenkymaalisen kudoksen hermosolujohdannaisten siirtäminen mahdollistaa teoriassa aivojen aineenvaihdunnan geneettisten poikkeavuuksien korjaamisen Gaucherin tautia ja muita lipidi-, gangliosidi- tai hiilihydraattiaineenvaihdunnan häiriöitä sairastavilla potilailla.

Kokeelliset olosuhteet luuytimen stroomasolujen transdifferentiaatiolle hermo- ja maksakudoksen progenitorisoluiksi ovat käynnissä. Tutkijoiden huomio keskittyy erilaistumisen indusoijien ja erityisten soluviljelyalustojen yhdistelmiin. Erityisesti stroomasolujen primaariviljelmän eristämiseksi luuydinsolut, jotka on pesty ja suspendoitu uudelleen DMEM/F12 (1/1) -viljelyalustassa, jossa on 10 % sikiön vasikanseerumia, kylvetään tiheydellä 200 000/cm2. 24 tunnin kuluttua irralliset solut poistetaan ja muoviin kiinnittyneitä fibroblastien kaltaisia soluja viljellään viikon ajan. Luuytimen stroomasolujen erilaistumiseen neuroblasteiksi käytetään hiiren alkion fibroblastien primaariviljelmän kolmen päivän viljelyllä saatua soluviljelyalustaa sekä DMEM/F12-alustaa (1/1), jossa on 2 % sikiön vasikanseerumia ja johon on lisätty 20 ng/ml NF:ää tai 10-6 M retinoiinihappoa (neuroindusoijia, joita käytetään hiiren ja ihmisen alkion kantasolujen hermostolliseen erilaistumiseen). Luuytimen stroomasolujen erilaistuminen maksasolujen kantasoluiksi indusoidaan hiiren alkion maksasolujen primaariviljelmän kolmen päivän DMEM/F12-elatusaineessa (1/1) tehdyssä viljelyssä, johon on lisätty 10 % vasikan sikiön seerumia.

Tässä on jälleen kerran huomattava, että luuytimen strooman pesäkkeitä muodostavat solut ovat heteromorfisia ja ne voidaan jakaa kahteen tyyppiin. Ensimmäiseen tyyppiin kuuluvat fibroblastien kaltaiset solut, jotka muodostavat filopodioita, joilla on suuret tumat ja yksi tai kaksi tumanukleolia. Toista tyyppiä edustavat pienet karanmuotoiset solut. Kun molempien tyyppien soluja viljellään hiiren alkion fibroblastien primaarisilla syöttökerroksella saadussa soluviljelyssä, neuroblastien kaltaisia soluja ilmestyy viljelmään 3.–4. päivänä. Tässä vaiheessa niillä on useimmiten karanmuotoinen muoto, jossa on yksi tai kaksi pitkää haaraketta, jotka päättyvät filopodioihin. Harvinaisempia ovat pyramidi- tai tähtisolut, joilla on lyhyet dendriitit. Joidenkin neuroblastien dendriiteillä on tyypillisiä laajennuksia (kasvunuppuja) ja haaroja distaalisessa osassaan, kun taas toisilla on erilliset kasvukartiot filopodioineen, joiden läpi dendriitit kasvavat. Samanlaisia morfologisia piirteitä (silmut ja kasvukartiot filopodioineen), jotka ovat ominaisia neuroneiksi erilaistuville neuroblasteille, on kuvattu yksityiskohtaisesti neurogeneesiä koskevissa tutkimuksissa. Tämän perusteella jotkut kirjoittajat päättelevät, että viljelmästä löytämänsä solut ovat neuroblasteja. Erityisesti E. Shchegelskaya ja hänen kanssaan (2002) havaitsivat viljeltyään stroomasolujen primaariviljelmää kahden viikon ajan joka 3.–4. päivä vaihdetussa soluviljelyalustassa, että osa soluista lisääntyi säilyttäen samalla erilaistumattoman tilansa. Ulkoisesti tällaiset solut muistuttivat fibroblasteja ja niitä havaittiin viljelmässä yhdessä erilaistuvien neuroblastien kanssa. Suurin osa soluista (noin 80 %) oli hermokudoksen soluiksi, pääasiassa neuroneiksi, erilaistumisen eri vaiheissa. Näiden solujen dendriittihaarakkeet olivat läheisessä kosketuksessa toisiinsa, joten solut muodostivat vähitellen hermoverkon osia substraatille pitkien monisoluisten säikeiden muodossa. Neuroblastien dendriittihaarakkeet pitenivät merkittävästi, jotkut niistä ylittivät hermosolun rungon pituuden 8–10 kertaa. Pyramidi- ja tähtisolujen osuus kasvoi vähitellen. Tähtisolujen dendriitit haarautuivat. Kirjoittajien mukaan pyramidi- ja tähtisolujen myöhäisempi erilaistuminen karanmuotoisiin soluihin verrattuna vastaa eläinten normaalin neurogeneesin vaihejärjestystä. Tämän seurauksena kirjoittajat päättelevät, että luuytimen strooman kantasolut käyvät läpi indusoidun neurogeneesin, jonka aikana kaikki kolme neuronien päätyyppiä muodostuvat neuroblasteista in vitro. Hermosolujen esiasteita havaittiin myös luuytimen strooman solujen viljelyn aikana 3-4 päivän ajan 2 % sikiöseerumia ja 20 ng/ml LIF:iä sisältävässä elatusaineessa. Mutta tässä tapauksessa kantasolut jakautuivat hyvin hitaasti, neuroblastien erilaistuminen tapahtui vain 30 %:ssa tapauksista, eivätkä ne muodostaneet hermosoluverkostoja. Käyttämällä retinoiinihappoa yhtenä hermosolujen erilaistumisen indusoijana kirjoittajat saivat jopa 25-30 % hermosoluista viljelmästä,jossa gliaelementtejä oli pääasiassa - astrosyyttejä ja oligodendrosyyttejä. Neuronit muodostivat vain kolmanneksen kaikista hermosoluista, vaikka niitä edustivat kaikki kolme tyyppiä: karanmuotoiset, pyramidimaiset ja tähtisolut. Kuudentena päivänä, kun stroomasoluja viljeltiin retinoiinihappoa sisältävässä elatusaineessa, hermosolut erilaistuivat ja yksittäisissä pyramidisoluissa havaittiin aksoneja, jotka normaalissa neuroontogeneesissä ilmestyvät myöhemmin kuin dendriittisten prosessien muodostuminen. Kirjoittajien mukaan hermosolujen alhaisesta saannosta huolimatta retinoiinihapon induktiomenetelmällä on etunsa: oligodendrosyytit ja astrosyytit suorittavat myelinointi- ja ravitsemustehtäviä dendriittien ja aksonien kasvun aikana ja ovat välttämättömiä hermokudoksen normaalille muodostumiselle. Siksi sen vaurioituneiden alueiden korjaamiseksi in vivo on parempi käyttää gliasoluilla rikastettua neuronisuspensiota.

Toisessa koesarjassa kirjoittajat yrittivät indusoida luuytimen stroomasolujen erilaistumista maksasoluiksi. Kolmen päivän kuluttua luuytimen stroomakantasolujen viljelystä hiiren alkion maksasolujen inkuboinnista saadussa soluviljelyalustassa havaittiin suuria, pallomaisia soluja, usein kaksitumaisia, joissa oli erikokoisia sytoplasmisia sulkeumia. Nämä solut olivat erilaistumisen eri vaiheissa ja erosivat toisistaan kooltaan, tumien lukumäärältään ja sytoplasman sulkeumien suhteen. Useimmissa näistä soluista havaittiin glykogeenia, minkä perusteella kirjoittajat tunnistivat ne maksasolujen esiastesoluiksi. Koska viljelmästä ei löytynyt neuroblastien kaltaisia soluja, pääteltiin, että alkion maksasolujen viljelyn tuloksena saadusta soluviljelyalustasta puuttui hermosolujen erilaistumistekijöitä ja päinvastoin se sisälsi tekijöitä, jotka indusoivat luuytimen stroomasolujen erilaistumista maksasolujen esiastesoluiksi. Yhteenvetona voidaan todeta, että kirjoittajat ehdottavat pluripotenssin esiintymistä luuytimen stroomasoluissa, koska ne erilaistuvat in vitro hermo- tai maksakudossoluiksi käytetystä soluviljelyalustasta ja indusoijista riippuen.

Jotkut tutkimukset ovat todellakin osoittaneet oikein luuytimen stroomasolujen erilaistumisen sydänlihas-, rusto-, luu- ja hermokudossoluiksi. On näyttöä siitä, että luuytimen solujen joukossa on kantasolupopulaatioita, jotka kykenevät erilaistumaan maksasoluiksi. Näiden tietojen valossa edellä mainittujen hiirikokeiden tuloksia voidaan edelleen pitää lisävahvistuksena pluripotenttien mesenkymaalisten kantasolujen läsnäolosta luuytimessä, jotka kykenevät erilaistumaan aikuisen organismin eri kudosten soluiksi.

Mesenkymaalisten kantasolujen siirto

Kliinisessä transplantologiassa ihmisen mesenkymaalisia kantasoluja voidaan käyttää hematopoieettisten kantasolujen sekä niiden varhaisten pre-sitoutuneiden jälkeläisten lisääntymisen varmistamiseksi. Erityisesti autologisten hematopoieettisten kantasolujen ja MSC-solujen antaminen syöpäpotilaille suuren annoksen kemoterapian jälkeen nopeuttaa neutrofiilien ja verihiutaleiden määrän palautumista ääreisveressä. Mesenkymaalisten kantasolujen allo- ja autologisia siirtoja käytetään multippeli myelooma, aplastinen anemia ja spontaani trombosytopenia - sairauksien, jotka liittyvät hematopoieettisen kudoksen strooman primaariseen vikaan, hoitoon. Soluterapian tehokkuus onkohematologisessa patologiassa on monissa tapauksissa korkeampi strooman ja hematopoieettisten kantasolujen samanaikaisen käyttöönoton myötä, mikä ilmenee hematopoieesin palautumisen leikkauksen jälkeisenä aikana, alueellisten ja kiertävien syöpäsolujen epäselektiivisestä tuhoutumisesta johtuvien kuolemaan johtavien tulosten määrän vähenemisenä, jossa myös potilaan omat hematopoieettiset progenitorisolut kuolevat. MSC-solujen ja muiden multipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen käyttömahdollisuudet kliinisessä käytännössä johtuvat niiden suhteellisesta helposta saamisesta luuydinaspiraateista, viljelyviljelyn lisääntymisestä ja terapeuttisten geenien transfektiosta. Samanaikaisesti paikallisten kudosvaurioiden kompensoimiseksi voidaan käyttää monipotenttien mesenkymaalisten progenitorisolujen paikallista istutusta, ja mesenkymaalista alkuperää olevien kudosten systeemisten toimintahäiriöiden tapauksessa niiden pääsyä yleiseen verenkiertoon ei suljeta pois.

Niiden teosten kirjoittajat, joissa analysoidaan mesenkymaalisten kantasolujen (MSC) käyttömahdollisuuksia paikallisissa, systeemisissä elinsiirroissa ja geeniterapiassa stroomasolujen biologian näkökulmasta, ovat päättelyssään varovaisempia. Synnytyksen jälkeistä luuydintä pidetään perinteisesti elimenä, joka koostuu kahdesta selkeästi määritellyistä solulinjoista - itse hematopoieettisesta kudoksesta ja siihen liittyvästä tukevasta stroomasta. Siksi luuytimen mesenkymaalisia kantasoluja pidettiin aluksi yksinomaan stroomasolujen perustana hematopoieettisen mikroympäristön säätelytekijöiden tuotannolle. Sitten tutkijoiden huomio kiinnittyi MSC-solujen roolin tutkimiseen luuston kudosten kantasolulähteenä. Uusimmat tiedot osoittavat odottamattoman potentiaalin luuytimen stroomasolujen erilaistumiselle hermo- tai lihaskudoksen muodostumiseksi. Toisin sanoen mesenkymaalisilla kantasoluilla on transgermaalinen plastisuus - kyky erilaistua solutyypeiksi, jotka eivät fenotyyppisesti ole sukua alkuperäisen kudoksen soluille. Samaan aikaan jotkin luuytimen stroomasolujen biologian näkökohdat ovat edelleen epäselviä ja ratkaisemattomia sekä yleisellä biologisella tasolla että yksittäisissä yksityiskohdissa, mukaan lukien luuytimen stroomasolujen tunnistaminen, luonne, alkuperä, kehitys ja toiminta in vivo sekä sallittu erilaistumispotentiaali ex vivo ja terapeuttisen käytön mahdollisuudet in vivo. MSC-solujen potentiaalista saadut tiedot sekä muiden kantasolujen regeneratiivista potentiaalia koskevien tutkimusten tulokset ovat jyrkässä ristiriidassa biologiassa vakiintuneiden dogmien kanssa.

Kun luuytimen strooman kantasoluja viljellään pienessä tiheydessä, ne muodostavat erillisiä pesäkkeitä, joista jokainen on peräisin yhdestä kantasolusta. Strooman kantasolujen prosenttiosuus tumallisissa luuydinsoluissa, joka määräytyy pesäkkeidenmuodostuskyvyn perusteella, riippuu suuresti sekä viljelyolosuhteista että MSC-lajeista. Esimerkiksi jyrsijöillä sädehoitoisten luuytimen syöttäjäsolujen ja seerumin läsnäolo viljelmässä on ehdottoman välttämätöntä strooman kantasolujen maksimaalisen määrän saamiseksi, kun taas ihmisillä mesenkymaalisten kantasolujen pesäkkeidenmuodostustehokkuus on riippumaton sekä syöttäjästä että viljelyalustasta. Tunnettujen mitogeenisten tekijöiden, jotka stimuloivat strooman kantasolujen lisääntymistä, määrä on rajallinen. Näitä ovat PDGF, EGF, FGF, TGF-b ja IGF1. Optimaalisissa viljelyolosuhteissa polyklonaaliset MSC-solulinjat kestävät yli 50 solunjakautumista in vitro, mikä mahdollistaa miljardien luuytimen strooman solujen saamisen 1 ml:sta aspiraattia.

Luuytimen stroomasolujen populaatio on kuitenkin heterogeeninen, mikä ilmenee sekä pesäkkeiden koon vaihteluna, niiden muodostumisen eri nopeuksina että solumorfologian monimuotoisuutena, joka kattaa alueen fibroblastimaisista karanmuotoisista suuriin litteisiin soluihin. Tällaisten viljelmien kehityksen aikana havaitaan myös fenotyyppistä heterogeenisyyttä 20 päivän kuluttua. Joillekin pesäkkeille on ominaista alkalisen fosfataasin korkea ilmentyminen, toiset eivät ilmennä sitä ollenkaan, ja kolmannen tyypin pesäkkeet ovat fosfataasipositiivisia keskialueella ja fosfataasinegatiivisia reuna-alueilla. Yksittäiset pesäkkeet muodostavat luukudoksen kyhmyjä (matriisin mineralisaation alkaminen havaitaan värjäytymällä alitsariinipunaisella tai kalsiumilla Van Kossin mukaan). Toisissa pesäkkeissä tapahtuu rasvan kertymistä, joka tunnistetaan G-värjäyksellä öljypunaisella. Harvemmin mesenkymaalisten kantasolujen pesäkkeet muodostavat rustoja, jotka värjätään Alcian-sinisellä.

Koe-eläimiin tehdyn ektooppisen siirron jälkeen polyklonaaliset MGK-solulinjat muodostavat ektooppista luuta, jossa on retikulaarinen strooma, joka liittyy myelopoieesiin ja adiposyytteihin, ja harvemmin rustokudokseen. Kun luuytimen stroomasolujen monoklonaalisia linjoja siirretään, havaitaan joissakin tapauksissa kimerismiä, jossa de novo -luu koostuu luukudossoluista, sisältää luovuttajalta peräisin olevaa stroomaa ja adiposyyttejä, kun taas hematopoieettisen linjan ja verisuoniston solut ovat peräisin vastaanottajalta.

Näiden tutkimusten tulokset vahvistavat luuytimen strooman progenitorisolun, josta klonaalinen solulinja on peräisin, kantasoluluonteen. Ne osoittavat myös, että kaikki viljelmässä klonogeenisesti kehittyneet solut eivät ole todella multipotentteja kantasoluja. Jotkut tutkijat uskovat, ja me jaamme heidän mielipiteensä, että luotettavinta tietoa yksittäisten kloonien todellisesta erilaistumispotentiaalista voidaan saada vasta in vivo -elinsiirron jälkeen, eikä määrittämällä niiden johdannaisten fenotyyppiä in vitro. Osteo-, kondro- tai adipogeneesin fenotyyppisten markkereiden ilmentyminen viljelmässä (määritettynä mRNA:lla tai histokemiallisilla tekniikoilla) ja jopa mineralisoituneen matriisin tuotanto eivät heijasta yksittäisen kloonin pluripotenssiastetta in vivo. Siksi kantasolujen tunnistaminen strooman soluryhmässä on mahdollista vain jälkikäteen, biologisen elinsiirtomäärityksen sopivissa olosuhteissa. Erityisesti kondrogeneesiä havaitaan hyvin harvoin avoimissa elinsiirtojärjestelmissä, kun taas ruston muodostuminen on kaikkea muuta kuin harvinaista suljetuissa järjestelmissä, kuten diffuusiokammioissa tai strooman solujen in vitro -mikromassaviljelmissä, joissa saavutetaan paikallinen alhainen happipaine, mikä edistää rustokudoksen muodostumista. Siksi jopa siirtotekniikka sekä epäspesifiset in vitro -viljelyolosuhteet vaikuttavat merkittävästi MSC-erilaistumisen laajuuteen.

Kokeellinen elinsiirto tietyissä kokeellisissa olosuhteissa on kultainen standardi luuytimen stroomasolujen erilaistumispotentiaalin määrittämiseksi ja keskeinen tekijä niiden tunnistamisessa. Historiallisesti luuytimen stroomasolujen siirtoa koskevat tutkimukset liittyvät luuytimensiirron yleiseen ongelmaan. On todettu, että hematopoieettinen mikroympäristö luodaan siirtämällä luuytimen stroomasolulinjoja ja se tarjoaa hematopoieettisen kudoksen ektooppisen kehityksen elinsiirtoalueella. Mikroympäristön alkuperä luovuttajalta ja hematopoieettinen kudos isännältä antavat meille mahdollisuuden pitää ektooppista luuta todellisena "käänteisenä" luuytimensiirtona. Luuytimen stroomasolujen paikallinen siirto edistää luuvirheiden tehokasta korjausta, joka on voimakkaampaa kuin spontaanissa korjaavassa uudistumisessa. Useat prekliiniset kokeellisten mallien tutkimukset ovat vakuuttavasti osoittaneet luuytimen stroomasolujen siirtojen käyttömahdollisuuden ortopediassa, vaikka näiden menetelmien optimoimiseksi tarvitaan huolellisinta työtä ja analyysiä jopa yksinkertaisimmissa tapauksissa. Erityisesti osteogeenisten stroomasolujen ex vivo -laajenemisen optimaalisia olosuhteita ei ole vielä vahvistettu, eikä ihanteellisen kantajan rakennetta ja koostumusta sekä luun volumetriseen uudistumiseen tarvittavien solujen määrää ole vielä kehitetty.

Ex vivo -laajennettujen luuytimen stroomasolujen käytön lisäksi mesenkymaalista alkuperää olevien kudosten regenerointiin, mesenkymaalisten kantasolujen epätavallinen plastisuus avaa potentiaalisia sovelluksia hermosolujen regenerointiin tai geenituotteiden toimittamiseen keskushermostoon. Periaatteessa tämä yksinkertaistaa hermostovaurioiden soluterapiaa, koska autologisia ihmisen hermostollisia kantasoluja ei tarvitse hankkia. Luuydinsolujen potentiaalisia sovelluksia sekä aitojen strooma- että ekstrastromaalista alkuperää olevien sydänlihassolujen ja myogeenisten progenitorisolujen tuottamiseen on raportoitu.

Luuytimen stroomasolujen systeemistä siirtoa yleisten luustosairauksien hoitoon tehdään parhaillaan kokeita. Ei ole epäilystäkään siitä, että luuytimen stroomasolut ovat vastuussa luustosairauksien geneettisistä häiriöistä, mitä havainnollistaa hyvin geneettisen tiedon siirtyminen vektorina näiden solujen avulla, mikä johtaa patologisen luukudoksen muodostumiseen koe-eläimillä. Strooman solujen kykyä implantoitua, kiinnittyä, lisääntyä ja erilaistua luustossa yleiseen verenkiertoon johtamisen jälkeen ei kuitenkaan ole vielä todistettu.

Tämä johtuu osittain siitä, että tavanomaisessa luuydinsiirrossa stroomaa ei siirretä yhdessä hematopoieettisen kudoksen kanssa, joten systeemisesti annettujen stroomasolujen onnistuneen kiinnittymisen arvioimiseksi ei ole vielä kehitetty tiukkoja kriteerejä. On muistettava, että markkerigeenien esiintyminen kudosuutteissa tai luovuttajaperäisten solujen eristäminen viljelmästä ei osoita solujen kiinnittymistä, vaan ainoastaan niiden selviytymistä. Jopa luuytimen stroomasolujen valtimonsisäinen injektio hiiren raajaan voi johtaa käytännössä nollaan kiinnittymiseen, vaikka luovuttajaperäisiä soluja löytyy suuria määriä luuytimen mikrovaskulaatiosta. Valitettavasti tällaisia soluja kuvataan yleensä "kiintyneiksi" yksinkertaisesti luovuttajasolujen markkerigeenien havaitsemisen perusteella ex vivo -viljelmässä. Lisäksi on esitettävä vakuuttavia todisteita luovuttajaperäisten erilaistuneiden ja toiminnallisesti aktiivisten solujen pitkäaikaisesta integroitumisesta tutkittaviin kudoksiin. Monissa julkaistuissa artikkeleissa, joissa raportoidaan luuytimen stroomasolujen kiinnittymisestä luustoon, tämänkaltaisen selkeän tiedon puute on silmiinpistävää. On kuitenkin huomattava, että joissakin oikeissa eläinkokeissa on todellakin havaittu rajoitettua mutta todellista strooman progenitorisolujen kiinnittymistä niiden systeemisen annon jälkeen.

Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia tutkimustulosten kanssa, jotka käsittelevät luuytimen myogeenisten progenitorisolujen toimittamista lihakseen verisuoniston kautta. Ei kuitenkaan pidä unohtaa, että sekä luusto- että lihaskudos muodostuvat kehityksen ja kasvun aikana ekstravaskulaaristen solujen liikkeiden perusteella, jotka käyttävät migraatioprosesseja, joihin ei liity verenkiertoa. Jos on olemassa itsenäinen verenkiertoreitti progenitorisolujen toimittamiseksi kiinteän faasin kudoksiin, voidaanko olettaa, että on olemassa fysiologisesti verenkierrossa olevia mesenkymaalisia progenitorisoluja? Mikä on näiden solujen alkuperä sekä kehittyvässä että postnataalisessa organismissa, ja miten ne tunkeutuvat verisuonen seinämään? Näiden kysymysten ratkaiseminen vaikuttaa ehdottoman välttämättömältä ja vaatii erittäin huolellista prekliinistä analyysia. Vaikka näihin kysymyksiin löydettäisiin vastaukset, luuston kasvuun ja sidekudoksen uudelleenmuodostukseen liittyvät ongelmalliset kineettiset näkökohdat jäävät ratkaisematta. Samaan aikaan osteogeneesin häiriöiden hoito korvaamalla koko mutatoituneiden luuston progenitorisolujen populaatio terveillä strooman elementeillä näyttää olevan todellinen kliininen mahdollisuus. Tässä tapauksessa patologisesta osteogeneesistä johtuvat paikalliset murtuma-alueet tai muodonmuutokset sekä luukudoksen tuhoisat muutokset voidaan korjata käyttämällä in vitro -viljeltyjä strooman kantasoluja. Siksi on suositeltavaa keskittyä tulevassa tutkimuksessa autologisten mutatoituneiden osteogeenisten progenitorisolujen transformaatioon tai geneettiseen korjaukseen ex vivo.

Solujen geenitekniikka, lyhytaikainen tai pysyvä, on muodostunut solu- ja molekyylibiologian perustaksi, ja se on monien tieteellisten löytöjen lähde, joka koskee yksittäisten proteiinien roolia solujen aineenvaihdunnassa in vitro ja in vivo. Molekyyliteknologioiden käyttö perinnöllisten patologioiden ja ihmisen sairauksien korjaamiseen on erittäin lupaavaa käytännön lääketieteelle, koska luuytimen stroomasolujen ominaisuudet mahdollistavat ainutlaatuisten siirto-ohjelmien kehittämisen luuston geneettisten sairauksien korjaamiseksi. Samanaikaisesti mesenkymaalisia kantasoluja voidaan helposti saada tulevalta vastaanottajalta, ne soveltuvat geneettiseen manipulointiin ja pystyvät lisääntymään suurina määrinä lyhyessä ajassa. Mesenkymaalisten kantasolujen käyttö mahdollistaa geneettisen informaatiomateriaalin toimittamiseen suoraan potilaalle intravaskulaaristen vektorirakenteiden kautta liittyvien rajoitusten ja riskien välttämisen. Samanlainen strategia soveltuu myös alkion kantasoluihin, mutta autologiset postnataaliset luuytimen stroomasolut ovat edullisempi materiaali, koska niiden lisääminen sulkee pois mahdolliset immunologiset siirron jälkeiset komplikaatiot. Lyhytaikaisen vaikutuksen saavuttamiseksi, esimerkiksi luun uudistumisen nopeuttamiseksi, optimaalisin menetelmä on mesenkymaalisten kantasolujen geneettinen modifikaatio käyttämällä elektroporaatiota, kemiallista fuusiota, lipofektiota, plasmideja ja adenovirusrakenteita. Erityisesti viruksen transfektio luuytimen stroomasoluihin BMP-2 on osoittautunut tehokkaaksi luun uudistumisen nopeuttamisessa kokeellisissa polytraumoissa. Adenovirusvektorirakenteiden luominen on edullista toksisuuden puuttumisen vuoksi. Luuytimen stroomasolujen geneettiselle modifikaatiolle on tässä tapauksessa kuitenkin ominaista erittäin alhainen stabiilius. Lisäksi normaalit transformoidut luuytimen stroomasolut vaativat geneettisen tiedon vektorikantajien käyttöä, jotka ovat 10 kertaa tarttuvampia kuin muut solutyypit, mikä lisää merkittävästi transfektoitujen solujen kuolemanprosenttia.

Tiettyjen geenien alhaisen tai nollan biologisen aktiivisuuden aiheuttamien resessiivisten sairauksien hoito vaatii mesenkymaalisten kantasolujen pitkäaikaista tai pysyvää modifiointia, mikä edellyttää adeno-assosioituneiden virusten, retrovirusten, lentivirusten tai adeno-retroviraalisten kimeerien käyttöä. Näiden virusten kuljetusalueet kykenevät siirtämään suuria DNA-transfekteja (jopa 8 kb). Tieteellisessä kirjallisuudessa on jo raportoitu luuytimen stroomasolujen eksogeenisestä biologisesta aktiivisuudesta, kun nämä solut on transfektoitu säätely- ja markkerimolekyylien - IL-3, CD2, tekijä VIII - sekä L-DOPA:n synteesiin osallistuvien entsyymien - synteesiä koodaavilla retrovirusrakenteilla. Kirjoittajat kuitenkin huomauttavat myös näissä tutkimuksissa useista rajoituksista, jotka on voitettava ennen tämän teknologian käytännön soveltamista. Ensimmäinen ongelma on MSC-modifikaatioprosessin optimointi ex vivo. Tiedetään, että luuytimen stroomasolujen pitkäaikainen (3-4 viikkoa) lisääntyminen in vitro vähentää niiden transfektiota. Samalla MSC-solujen korkean geneettisen modifioinnin saavuttamiseksi on tarpeen suorittaa useita transfektiosyklejä. Toinen ongelma liittyy terapeuttisen geeniekspression kestoon, joka ei vielä ylitä neljää kuukautta. Tehokkaan geeniekspression luonnollinen väheneminen johtuu promoottorien inaktivoitumisesta ja modifioitujen solujen kuolemasta. Mesenkymaalisten kantasolujen avulla tapahtuvan geneettisen tiedon siirron yleisten näkymien valossa alustavien tutkimusten tulokset osoittavat, että ex vivo -transfektiomenetelmiä on optimoitava edelleen, valittava riittävä promoottori, joka säätelee biologista aktiivisuutta haluttuun suuntaan, ja että modifioitujen luuytimen stroomasolujen kykyä itseään ylläpitää in vivo siirron jälkeen on lisättävä. On huomattava, että retrovirusrakenteiden käyttö luuytimen stroomasolujen modifiointiin haluttuun suuntaan ei aina vaadi niiden pakollista kiinnittymistä. Transfektoidut mesenkymaaliset kantasolut voivat suorittaa korjaavan tehtävän vakaan sijainnin taustalla ja ilman pakollista aktiivista fyysistä liittymistä ja toimintaa sidekudokseen. Tässä tapauksessa niitä tulisi pitää biologisena minipumppuna, joka tuottaa in vivo tekijää, jonka puutos määrää geneettisen patologian ilmentymisen.

Transformoitujen luuytimen stroomasolujen käyttö dominantin geneettisen patologian hoitoon, jolle on ominaista patologisen tai epänormaalin biologisen aktiivisuuden omaavan geenin ilmentyminen, on paljon ongelmallisempaa, koska tässä tapauksessa on tarpeen estää vääristyneen geneettisen tiedon siirtyminen tai toteutuminen. Yksi geenitekniikan menetelmistä on alkion kantasolujen homologinen rekombinaatio transgeenisten eläinten luomiseksi. Erittäin alhainen homologisen rekombinaation aste yhdistettynä tällaisten rekombinanttien tunnistamiseen, erottamiseen ja laajenemiseen liittyviin ongelmiin ei kuitenkaan todennäköisesti edistä tämän menetelmän laajamittaista käyttöä lähitulevaisuudessa, vaikka uusia teknologisia menetelmiä kehitettäisiin. Toinen lähestymistapa dominantin patologian geeniterapiassa perustuu vaurioituneen DNA:n automaattiseen korjaamiseen, koska geneettiset mutaatiot voidaan korjata lisäämällä eksogeenistä DNA:ta halutulla sekvenssillä (lyhyet DNA-oligonukleotidit tai kimeeriset RNA/DNA-oligonukleotidit), joka sitoutuu vaurioituneen genomin homologeihin. Kolmas vaihtoehto sisältää patologisen tiedon siirron estämisen, mikä saavutetaan käyttämällä spesifisesti suunniteltuja oligonukleotideja, jotka sitoutuvat tiettyyn geeniin muodostaen kolmiosaisen kierrerakenteen, joka eliminoi transkription mahdollisuuden.

Vaikka geneettisen sairauden korjaaminen genomitasolla on edelleen optimaalisin ja edullisin hoitomenetelmä, mRNA on myös lupaava vektori (mahdollisesti jopa helpommin saatavilla) dominantin negatiivisen geenin estämiseksi. Proteiinimolekyylejä, joilla on antisense-oligonukleotidi tai täydelliset sekvenssit, jotka estävät mRNA:n sitoutumisen solun biosynteesijärjestelmään, on pitkään käytetty translaation estämiseen ja/tai mRNA:n hajoamisen lisäämiseen. Lisäksi kaksijuosteinen RNA indusoi nopeaa mRNA:n hajoamista, jonka mekanismi on edelleen epäselvä. On kuitenkin epätodennäköistä, että pelkkä mutanttialleelista transkriptoitujen mRNA:iden eliminointi lyhyillä tai yksittäisillä mutaatioilla edistäisi normaalin alleelin mRNA:n ilmentymistä. Vaihtoehto on vasarapää- ja hiusneularibosynteesien käyttö, joilla on kyky sitoutua mRNA:n erittäin spesifisiin alueisiin, jolloin ne pilkkoutuvat ja inaktivoituvat translaation aikana. Tämän menetelmän käyttömahdollisuuksia patologisen osteogeneesin hoidossa tutkitaan parhaillaan. Riippumatta siitä, mikä tarkalleen ottaen on kohde - genomiset vai sytoplasmiset elementit, uusien geeniterapiatekniikoiden menestys määräytyy reagenssien sisällyttämisen tehokkuuden perusteella luuytimen stroomasoluihin ex vivo, spesifisen vektorin optimaalisen valinnan ja mesenkymaalisten kantasolujen vakaan kyvyn ilmentää tarvittavia tekijöitä in vivo.

Mesenkymaalisten kantasolujen ja niiden odottamattomien ominaisuuksien löytäminen luo uuden käsitteellisen suunnitelman solulinjojen kehittämiselle. Tarvitaan kuitenkin lisää tieteidenvälistä tutkimusta strooman kantasolujen biologisen roolin, niiden luonteen, niiden kyvyn transdifferentioitua tai dedifferentioitua, niiden fysiologisen merkityksen ymmärtämiseksi alkionkehityksessä, postnataalisen kasvun, kypsymisen ja ikääntymisen aikana sekä ihmisen sairauksissa.