A-vitamiini veressä

A-vitamiinin (retinolin) pitoisuuden viitearvot (normaalit) veriseerumissa: 1–6-vuotiailla lapsilla - 0,7–1,5 μmol/l, 7–12-vuotiailla - 0,91–1,71 μmol/l, 13–19-vuotiailla - 0,91–2,51 μmol/l; aikuisilla - 1,05–2,09 μmol/l.

A-vitamiini on rasvaliukoinen vitamiini, ja sitä esiintyy kahdessa muodossa: itse A-vitamiinina eli retinolina (saatavilla vain eläintuotteista) ja provitamiinina A, karoteenina (saatavilla eläin- ja kasvituotteista), joka voidaan muuntaa retinoliksi ruoansulatuskanavan seinämissä. Noin 50–90 % ravinnon retinolista imeytyy ohutsuolessa ja kuljetetaan kylomikroniin sitoutuneena kompleksina maksaan, jossa se varastoituu retinolipalmitaattina. Tarvittaessa se vapautuu verenkiertoon retinolin ja A-vitamiinia sitovan proteiinin kompleksina. Veriseerumissa A-vitamiinia sitovan proteiinin ja retinolin kompleksi sitoutuu transtyretiiniin. Veriseerumista retinoli siirtyy kohdesoluihin, kuten verkkokalvon ja epiteelin valoreseptoreihin.

Kun elimistö saa A-vitamiinia enemmän kuin tarvitsee (180–430 mikrogrammaa retinolia päivässä iästä, sukupuolesta ja fysiologisesta tilasta riippuen), sen ylimääräinen määrä kertyy maksaan, jolloin muodostuu vitamiinivarasto. Kun retinolin saanti ruoan kanssa vähenee, sen varastot maksasta vapautuvat verenkiertoon, jolloin retinolin pitoisuus veriseerumissa pysyy normaalilla tasolla (yli 0,7 μmol/l). Muita biologisesti aktiivisia A-vitamiinin muotoja (retinaali ja retinoiinihappo) on veressä hyvin pieninä pitoisuuksina (alle 0,35 μmol/l); retinoliesterit muodostavat noin 5 % A-vitamiinin kokonaismäärästä (0,1–0,17 μmol/l).

A-vitamiinilla on tärkeä rooli hapetus-pelkistysprosesseissa. Retinoli edistää glykogeenin muodostumista maksassa ja lihaksissa, auttaa lisäämään veren kolesterolipitoisuutta ja osallistuu steroidi- ja sukupuolihormonien synteesiin. Se on välttämätön luuston kasvulle ja muodostumiselle, rodopsiinin uudelleensynteesille ja edistää myös limakalvojen ja ihon epiteelin normaalia toimintaa estäen sen metaplasiaa, hyperkeratoosia ja liiallista hilseilyä. A-vitamiini auttaa vahvistamaan hiuksia, hampaita ja ikeniä. Viime vuosina on osoitettu A-vitamiinin monipuolinen rooli syövän ehkäisyssä ja immuniteetin säätelyssä (se on välttämätön fagosytoosin loppuunsaattamiseksi, lisää Ig-synteesiä, stimuloi T-tappajien muodostumista, stimuloi tyypin II T-auttajasoluja jne.). A-vitamiini on aktiivinen antioksidantti, joka toimii pääasiassa E-vitamiinin läsnä ollessa; se suojaa C-vitamiinia hapettumiselta. A-vitamiinin puutosta pidetään pahanlaatuisten kasvainten riskitekijänä. Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että A-vitamiinipitoisuuden lisääminen ruokavaliossa pidentää keskimääräistä elinajanodotetta 17,5 %. Sinkki on välttämätön kofaktori A-vitamiinin aineenvaihdunnassa (välttämätön A-vitamiinia sitovan proteiinin synteesille).

Aikuisten (20–50-vuotiaiden) keskimääräinen päivittäinen retinolin tarve on 1,2 mg (4000 IU, 1 IU vastaa 0,3 mikrogrammaa retinolia), raskaana olevien naisten 1,5 mg (5000 IU), imettävien naisten 1,8 mg (6000 IU) ja yli 60-vuotiaiden 2,5 mg (10 000 IU). Vähintään kolmannes retinolin päivittäisestä tarpeesta tulisi saada elimistöön valmiina tuotteena; loput voidaan kattaa karotenoideilla, joista elimistö muodostaa retinolia. On otettava huomioon, että noin 30 % elintarvikkeiden retinolista tuhoutuu lämpökäsittelyn aikana. Retinolin aktiivisuus on kaksi kertaa suurempi kuin karoteenin, ja lisäksi vain 30–40 % jälkimmäisestä imeytyy suolistossa. Siksi ruokavaliota arvioitaessa uskotaan, että 1 mg retinolia vastaa noin 6 mg karotenoideja.

Retinolin (A-vitamiini) ja karotenoidien määritys veriseerumista Besseyn mukaan, L. Anisimovan muokkaamana

Menetelmän periaate

A-vitamiinin ja karotenoidien määritys perustuu niiden hydrolyysiin emäksisessä alkoholiliuoksessa, jota seuraa uuttaminen orgaanisten liuottimien seoksella.

Reagenssit

• 11 M kaliumhydroksidiliuos (KOH).
• 96 % etyylialkoholia.
• 1 M kaliumhydroksidiliuos (KOH) 96-prosenttisessa etyylialkoholissa: 1 tilavuusosa 11 M KOH-liuosta sekoitetaan 10 tilavuusosaan 96-prosenttista etyylialkoholia. Reagenssi valmistetaan tutkimuspäivänä. Jos sekoittamisen aikana ilmenee värjäytymistä, alkoholi on puhdistettava tislaamalla ennen käyttöä.
• Ksyleeni, kemiallisesti puhdas
• Oktaani, kemiallisesti puhdas
• Ksyleeni-oktaaniseos: valmistetaan sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet ksyleeniä ja oktaania.

Tutkimukset tehdään spektrofotometrillä.

A-vitamiinin määritysprosessi

Sormesta otettu veri (noin 1 ml) laitetaan sentrifugiputkeen ja laitetaan lasikuppiin lämpimän veden (lämpötila 40–45 °C) kanssa 20–30 minuutiksi. Seerumin erottamiseksi verihyytymä vedetään varovasti putken seinämien reunoja pitkin ohuella lasitangolla ja sentrifugoidaan nopeudella 3000 rpm 10 minuuttia.

0,12 ml seerumia kerätään ja siirretään agglutinaatioputkeen, johon lisätään sitten 0,12 ml 1 M kaliumhydroksidialkoholiliuosta. Sisältöä ravistetaan huolellisesti.

Koeputket, joissa on näytteitä, asetetaan 20 minuutiksi 60 °C:n lämpötilaan vesihauteeseen hydrolyysin suorittamiseksi.

Näytteet jäähdytetään ja niihin lisätään 0,12 ml ksyleeni-oktaaniseosta, ja niitä ravistetaan voimakkaasti 10–15 sekunnin ajan. Ne jäähdytetään uudelleen ja sentrifugoidaan.

A-vitamiinia ja karotenoideja sisältävä päällimmäinen kerros poistetaan varovasti kumipäällä varustetulla Pasteur-pipetillä ja siirretään mikrokyvetteihin.

Näytteet spektrofotometroidaan 328 nm:n aallonpituudella A-vitamiinin määrittämiseksi ja 460 nm:n aallonpituudella karotenoidien määrittämiseksi.

Spektrofotometrisen mittauksen jälkeen näytteet altistetaan ultraviolettisäteilylle A-vitamiinin tuhoamiseksi. Tätä varten kvartsilamppu (bakteerimyrkky) asennetaan 15–20 cm:n etäisyydelle mikrokyvetistä siten, että nesteellä täytetty kyvetin osa altistuu säteilylle; säteilytysaika on 45–60 minuuttia.

Näytteet spektrofotometroidaan uudelleen aallonpituudella 328 nm. A-vitamiinipitoisuus määritetään ekstinktioarvojen erotuksena (optinen tiheys) ottaen huomioon Besseyn A-vitamiinille laskema kerroin (tekijä) 637.

Laskelma suoritetaan kaavan mukaisesti:

X = 637 × (E328(1) - E328(2)),

Jossa X on A-vitamiinipitoisuus, μg/dl; 637 on Besseyn laskema kerroin A-vitamiinin määrittämiseksi; E328(1) on liuoksen optinen tiheys ennen säteilytystä; E328(2) on liuoksen optinen tiheys säteilytyksen jälkeen.

Kerroin A-vitamiinipitoisuuden muuntamiseksi yksiköstä µg/dl yksiköksi µmol/l on 0,035.

Karotenoidien pitoisuus lasketaan kaavalla:

X = 480 - E480,

Jossa X on karotenoidipitoisuus, μg/dl; 480 on Besseyn laskema kerroin karotenoidien määrittämiseksi; E480 on testiliuoksen optinen tiheys.

Huomautus

Besseyn mukaan tutkimuksessa voidaan käyttää suurempaa tai pienempää seerumitilavuutta, mutta sen suhteen alkoholiliuoksen tilavuuteen on oltava vakio ksyleeni-oktaaniseoksen tilavuuden (määrän) muuttuessa.

Normaali A-vitamiinipitoisuus veren seerumissa on: vastasyntyneillä ja imeväisillä - 160–270 μg/l; aikuisilla - 1,05–2,45 μmol/l (300–700 μg/l). Karotenoidien pitoisuus aikuisten veren seerumissa on 800–2300 μg/l.