Molekyyligeneettiset menetelmät perinnöllisten sairauksien diagnosoimiseksi

DNA-tekniikan menetelmiä käytetään määrittämään mutanttigeenin lokalisaatio tietyssä kromosomissa, joka on vastuussa tiettyjen perinnöllisten patologioiden muotojen alkuperästä. Koska geeni on DNA:n osa ja geenimutaatio on vaurio DNA:n primaarirakenteessa (mutaatiolla tarkoitetaan kaikkia DNA-sekvenssin muutoksia riippumatta niiden lokalisoinnista ja vaikutuksesta yksilön elinkelpoisuuteen), niin tutkimalla perinnöllistä sairautta sairastavan potilaan metafaasikromosomivalmisteita on mahdollista määrittää patologisen geenin lokalisaatio. Molekyyligeneettiset menetelmät luovat mahdollisuuksia sairauksien diagnosointiin muuttuneen DNA-rakenteen tasolla, ja ne mahdollistavat perinnöllisten häiriöiden lokalisaation määrittämisen. Molekyyligeneettiset menetelmät voivat tunnistaa mutaatioita, jotka liittyvät jopa yhden emäksen korvautumiseen.

Geenin tunnistamisen tärkein vaihe on sen eristäminen. DNA:ta voidaan eristää mistä tahansa kudoksesta ja solusta, joka sisältää tuman. DNA:n eristämisen vaiheisiin kuuluvat: solujen nopea lyysi, soluorganellien ja -kalvojen fragmenttien poistaminen sentrifugoimalla, proteiinien entsymaattinen tuhoaminen ja niiden uuttaminen liuoksesta fenolin ja kloroformin avulla sekä DNA-molekyylien konsentrointi saostamalla etanolissa.

Geneettisissä laboratorioissa DNA eristetään useimmiten veren leukosyyteistä, jolloin potilaalta otetaan 5–20 ml laskimoverta steriiliin koeputkeen antikoagulanttiliuoksen (hepariinin) kanssa. Sitten leukosyytit erotellaan ja käsitellään edellä mainittujen vaiheiden mukaisesti.

Tutkimusmateriaalin valmistelun seuraava vaihe on DNA:n "leikkaaminen" fragmenteiksi alueilla, joilla on tiukasti spesifinen emässekvenssi. Tämä suoritetaan käyttämällä bakteerientsyymejä - restriktioendonukleaaseja (restriktioentsyymejä). Restriktioentsyymit tunnistavat kaksijuosteisessa DNA-molekyylissä spesifisiä 4-6, harvemmin 8-12 nukleotidin sekvenssejä ja jakavat sen fragmentteihin näiden sekvenssien sijainneissa, joita kutsutaan restriktiokohdiksi. Tuloksena olevien DNA:n restriktiofragmenttien lukumäärä määräytyy restriktiokohtien esiintymistiheyden perusteella, ja fragmenttien koko määräytyy näiden kohtien jakautumisen luonteen perusteella alkuperäisen DNA-molekyylin pituudella. Mitä useammin restriktiokohdat sijaitsevat, sitä lyhyempiä DNA-fragmentit ovat restriktiovaiheen jälkeen. Tällä hetkellä tunnetaan yli 500 erilaista bakteeriperäistä restriktioentsyymiä, ja jokainen näistä entsyymeistä tunnistaa oman spesifisen nukleotidisekvenssinsä. Tulevaisuudessa restriktiokohtia voidaan käyttää DNA:n geneettisinä markkereina. Restriktiovaiheen seurauksena muodostuneet DNA-fragmentit voidaan järjestää pituuden mukaan elektroforeesilla agaroosi- tai polyakryyliamidigeelissä, ja siten niiden molekyylipaino voidaan määrittää. Tyypillisesti geelissä oleva DNA tunnistetaan spesifisellä värjäyksellä (yleensä etidiumbromidilla) ja tarkastelemalla geeliä läpäisevässä ultraviolettivalossa. DNA:n lokalisaatiokohdat ovat punaisia. Ihmisillä, kun DNA:ta käsitellään useilla restriktioentsyymeillä, muodostuu kuitenkin niin paljon eri pituisia fragmentteja, ettei niitä voida erottaa elektroforeesilla, eli yksittäisiä DNA-fragmentteja ei voida visuaalisesti tunnistaa elektroforeesissa (tasainen värjäys saadaan koko geelin pituudelta). Siksi haluttujen DNA-fragmenttien tunnistamiseksi tällaisessa geelissä käytetään hybridisaatiomenetelmää leimattujen DNA-koettimien kanssa.

Mikä tahansa yksijuosteinen DNA- tai RNA-segmentti pystyy sitoutumaan (hybridisoitumaan) komplementaariseen juosteeseen, guaniinin sitoutuessa aina sytosiiniin ja adeniinin tymiiniin. Näin muodostuu kaksijuosteinen molekyyli. Jos kloonatun geenin yksijuosteinen kopio leimataan radioaktiivisella leimalla, saadaan koetin. Koetin pystyy löytämään komplementaarisen DNA-segmentin, joka sitten tunnistetaan helposti autoradiografialla. Venytettyjen kromosomien valmisteeseen lisätty radioaktiivinen koetin mahdollistaa geenin lokalisoinnin tietylle kromosomille: DNA-koettimen avulla voidaan tunnistaa tietyt alueet Southern-blottauksen aikana. Hybridisaatio tapahtuu, jos testattava DNA-jakso sisältää normaalin geenin. Tapauksessa, jossa on epänormaali nukleotidisekvenssi eli vastaavat kromosomirakenteet sisältävät mutanttigeenin, hybridisaatiota ei tapahdu, mikä mahdollistaa patologisen geenin lokalisaation määrittämisen.

DNA-koettimien saamiseksi käytetään geenikloonausmenetelmää. Menetelmän ydin on se, että geeniä tai geenin osaa vastaava DNA-fragmentti insertoidaan kloonauspartikkeliin, yleensä bakteeriplasmidiin (bakteerisoluissa oleva rengasmainen ekstrakromosomaalinen DNA, joka sisältää antibioottiresistenssigeenejä), ja sitten bakteerit, joihin on insertoitu ihmisgeeni, lisääntyvät. Plasmidin synteesiprosessien ansiosta voidaan saada miljardeja kopioita ihmisgeenistä tai sen osasta.

Tuloksena olevia DNA-kopioita, jotka on merkitty radioaktiivisella leimalla tai fluorokromeilla, käytetään sitten koettimina etsimään komplementaarisia sekvenssejä tutkittujen DNA-molekyylien joukosta.

Tällä hetkellä on olemassa monia erilaisia menetelmiä, joissa DNA-koettimia käytetään geenimutaatioiden diagnosointiin.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]