Nivelrikon kokeelliset mallit

Rusto on pitkälle erikoistunut kudos, joka sisältää vain yhden tyyppisiä soluja (kondrosyyttejä) ja jolle on ominaista veren ja imusuonten puuttuminen. Rustoa ravitsee pääasiassa nivelnesteen imeytyminen. Rustosolujen aineenvaihduntaa säätelevät useat liukoiset tekijät, joita kondrosyytit ja ympäröivät kudokset tuottavat paikallisesti. Rustosolujen toiminta riippuu myös solunulkoisen ympäristön koostumuksesta (happipaine, ionipitoisuus, pH jne.), solunulkoisen massan (ECM) koostumuksesta, solujen ja matriisin vuorovaikutuksesta sekä fysikaalisista signaaleista. Kokeellisen mallinnuksen päätavoitteena on luoda viljelmiä solunulkoisessa ympäristössä muuttamatta kypsien solujen fenotyyppiä. Toinen tavoite on luoda viljelmiä, joilla tutkitaan kondrosyyttien ennenaikaista, viivästynyttä, lyhytaikaista tai pitkittynyttä vastetta kemiallisiin ja/tai fysikaalisiin signaaleihin. In vitro -tutkimukset tarjoavat myös mahdollisuuden tutkia kondrosyyttien käyttäytymistä nivelrikossa. Kolmas tavoite on kehittää yhteisviljelyjärjestelmiä, joiden avulla voidaan tutkia eri kudosten vuorovaikutuksia nivelessä. Neljäs tehtävä on rustoimplanttien valmistelu myöhempää siirtoa varten. Ja lopuksi, viides tehtävä on tutkia kasvutekijöitä, sytokiineja tai terapeuttisia aineita, jotka kykenevät stimuloimaan korjausta ja/tai estämään ruston imeytymistä.

Viime vuosikymmeninä on luotu erilaisia nivelrustosoluviljelmämalleja, mukaan lukien yksikerrosviljelmät, suspensioviljelmät, kondroniviljelmät, eksplantaattiviljelmät, yhteisviljelmät ja kuolemattomat soluviljelmät. Jokaisella viljelmällä on omat etunsa ja haittansa, ja jokainen soveltuu yhden tietyn kondrosyyttiaineenvaihdunnan osa-alueen tutkimiseen. Siten rustoeksplantaatit ovat erinomainen malli matriisielementtien vaihtuvuuden tutkimiseen, mikä edellyttää aitoja solun pintareseptoreita sekä normaaleja solu-matriisi- ja matriisi-solu-vuorovaikutuksia. Samanaikaisesti on suositeltavaa tutkia matriisikerrostumia tai kondrosyyttien aineenvaihduntaa sääteleviä mekanismeja eristettyjen solujen viljelmässä. Matalatiheyksinen yksikerrosviljelmä on välttämätön solujen erilaistumisprosessin tutkimiseksi. Luonnolliseen tai synteettiseen matriisiin suspendoidut viljelmät ovat malli kondrosyyttien mekaaniseen rasitukseen reagoivan adaptiivisen vasteen analysointiin.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Kondrosyyttiviljelmät

Useita tärkeitä seikkoja on otettava huomioon valittaessa rustoa in vitro -tutkimuksiin. Rudosyyttien matriisikoostumus ja metabolinen aktiivisuus vaihtelevat nivelten välillä, ja jälkimmäinen riippuu myös kondrosyyttien sijainnin syvyydestä kudoksessa. Nämä tiedot saatiin useissa kokeissa, joissa tutkittiin eri syvyyksistä peräisin olevia eristettyjä kondrosyyttien alaryhmiä. Nivelruston pinnallisessa ja syvässä kerroksessa sijaitsevien viljeltyjen kondrosyyttien välillä havaittiin useita morfologisia ja biokemiallisia eroja. Pinnalliset solut syntetisoivat harvaa, proteoglykaaniköyhää fibrillaarista matriisia, kun taas syvemmät solut tuottavat fibrillejä ja proteoglykaaneja sisältävää matriisia. Lisäksi pinnalliset solut tuottavat suhteellisesti enemmän pieniä, aggregoitumattomia proteoglykaaneja ja hyaluronihappoa ja suhteellisesti vähemmän aggrekaania ja kerataanisulfaattia kuin syvemmät kondrosyytit. Toinen tärkeä eri syvyyksistä rustoalueista eristettyjen kondrosyyttien aineenvaihdunnan erottuva piirre on vaste eksogeeniseen ärsykkeeseen. M. Aydelotte et al.:n mukaan ruston pinnallisesta alueesta peräisin olevat naudan kondrosyytit olivat herkempiä IL-1:lle kuin syvän alueen solut.

Solujen käyttäytyminen riippuu myös kudoksen sijainnista. Saman eläimen kylkiluun ja korvan ruston rustosolut reagoivat eri tavoin kasvutekijöihin, kuten fibroblastikasvutekijään (FGF) ja TGF-beetaan. FGF lisäsi tymidiinin, proliinin ja leusiinin liittymistä viljeltyihin kylkiluun, mutta ei korvan kondrosyytteihin. TGF-beeta lisäsi tymidiinin liittymistä kylkiluun ja korvan ruston kondrosyytteihin, mutta sillä ei ollut vaikutusta tymidiinin ja proliinin liittymiseen korvan kondrosyytteihin. Ruston solut, jotka ovat peräisin suuresta rasituksesta kärsiviltä alueilta, eroavat soluista, jotka ovat peräisin ruston soluista, joilla on pienempi rasitus. Siten kypsän lampaan polvinivelen ruston kondrosyytit sääriluun nivelpinnan keskialueelta, jota ei peitä meniski, jolla on suurin kuormitus in vivo, syntetisoivat vähemmän aggrekaania, mutta enemmän dekoriinia kuin meniskin peittämiltä alueilta peräisin olevat solut. Kirjoittajat korostavat myös identtisistä nivelalueista peräisin olevan ruston käytön tärkeyttä nivelten synteettistä toimintaa tutkittaessa.

Rudosyyttien aineenvaihdunta ja niiden vaste säätelytekijöille riippuvat myös merkittävästi luovuttajan iästä, luuston kehityksestä ja niiden nivelten kunnosta, joista solut on otettu. Ihmisen kondrosyyteissä havaitaan merkittävä proliferatiivisen vasteen väheneminen iän myötä. Suurin lasku havaitaan 40–50-vuotiailla ja yli 60-vuotiailla luovuttajilla. Lisäksi proliferatiivisen vasteen vakavuus kasvutekijöille (esim. FGF ja TGF-beeta) vähenee iän myötä. Rudosyyttien proliferaation määrällisten muutosten lisäksi on myös laadullisia muutoksia. Nuorten luovuttajien (10–20 vuotta) solut reagoivat paremmin verihiutaleista peräisin olevaan kasvutekijään (PDGF) kuin TGF-beetaan, kun taas aikuisten luovuttajien soluissa havaitaan päinvastaista. Useita mekanismeja käytetään selittämään iästä riippuvia muutoksia kondrosyyttien synteettisessä toiminnassa ja niiden vasteessa kasvutekijöille. Näitä ovat pintasolujen reseptorien määrän ja affiniteetin väheneminen, kasvutekijöiden ja sytokiinien synteesin ja bioaktiivisuuden muutokset sekä reseptorin jälkeisten signaalien muutokset.

Nivelten patologinen tila muuttaa myös kondrosyyttien morfologiaa ja metabolista aktiivisuutta. Niinpä J. Kouri ym. (1996) tunnistivat kolme kondrosyyttien alaryhmää nivelrikkoon sairastuneessa rustossa. Ruston pinnallisen ja keskiosan yläosan rustosolut muodostavat kasautumia ja syntetisoivat suuremman määrän proteoglykaaneja ja kollageenia. TGF-beeta ja insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) kykenevät stimuloimaan kondrosyyttien proteoglykaanien synteesiä ja osittain neutraloimaan IL-1:n ja TNF-a:n vaikutuksia. Nivelrikon vaurioittaman ruston eksplantaatit ja nivelrikkopotilaan rustosta eristetyt kondrosyytit ovat herkempiä TGF-beetan stimulaatiolle kuin terveen ruston kondrosyytit. Nämä erot liittyvät todennäköisimmin nivelruston ylempien kerrosten kondrosyyttien fenotyyppisiin muutoksiin.

Yksittäisten kondrosyyttien eristäminen saavutetaan käsittelemällä ECM:ää peräkkäin proteolyyttisillä entsyymeillä. Vapauduttuaan ECM:stä eristetyt solut sopivat ihanteellisesti matriisikomponenttien de novo -synteesin tutkimiseen. Jotkut kirjoittajat käyttävät vain klostridiaalista kollagenaasia, kun taas toiset esi-inkuboivat rustoa trypsiinin, pronaasin, DNaasin ja/tai hyaluronidaasin kanssa. Eristettyjen solujen määrä riippuu käytetyistä entsyymeistä. Siten pelkällä kollagenaasilla käsiteltäessä yhdestä grammasta kudosta voidaan saada ^1,4–106 kondrosyyttiä, kun taas pronaasia, hyaluronidaasia ja kollagenaasia käytettäessä luku on 4,3–106 ^. Kollagenaasilla käsiteltäessä aggrekaania, proteiineja, IL-6:ta ja IL-8:aa jää soluviljelmään huomattavasti suurempina määrinä kuin eri entsyymeillä peräkkäin käsiteltäessä. Näille kahden soluviljelmän eroille on useita selityksiä:

• Solujen reseptorit vaurioituvat tai estyvät entsyymien vaikutuksesta, TGF-beeta estää DNA:n ja proteoglykaanin synteesiä vasta eristetyissä kondrosyyteissä (päivä 1), kun taas yksikerroksisessa viljeltyjen kondrosyyttien (7 päivää) DNA:n ja proteoglykaanin synteesi stimuloituu TGF-beetan vaikutuksesta. Näiden kalvokomponenttien uudelleen ilmentymiseen tarvitaan kuitenkin riittävä aika ennen kokeen alkua.
• Eksogeeniset proteaasit voivat häiritä integriinien välittämää solu-matriisivuorovaikutusta. Integriiniperhe edistää kondrosyyttien kiinnittymistä ECM-molekyyleihin (Shakibaei M. et al., 1997). Tämä häiriö voi vaikuttaa matriisigeenien ilmentymiseen.
• Matriisikomponenttien jäänteet voivat säädellä kondrosyyttien synteettistä toimintaa. Integriinit kykenevät tunnistamaan ECM:n hajoamistuotteet, ja niillä on siten tärkeä rooli kudosten korjautumisessa proteolyyttisten entsyymien vaikutuksen jälkeen. T. Larsson ym. (1989) raportoivat, että ehjien tai fragmentoituneiden proteoglykaanien lisääminen soluviljelmään stimuloi proteiinien ja proteoglykaanien synteesiä. Korkea hyaluronihappopitoisuus kuitenkin aiheuttaa merkittävän vähenemisen sulfaattien sisällyttämisessä proteoglykaanien synteesiin kanan alkion kondrosyyteissä, sian kypsissä kondrosyyteissä ja rotan kondrosarkoomasoluissa. Lisäksi hyaluronihappo estää proteoglykaanien vapautumista soluista jopa IL-1b:n, TNF-a:n ja FGF:n läsnä ollessa, mikä viittaa kasvutekijöiden ja sytokiinien ensimmäisen biologisen aktiivisuuden vastavaikutukseen. Hyaluronihapon vaikutuksen taustalla oleva tarkka mekanismi on edelleen epäselvä; kondrosyyttien tiedetään sisältävän hyaluronihapon reseptorin, joka liittyy sytosolin aktiinifilamentteihin. Hyaluronihapon sitoutuminen reseptoriinsa stimuloi proteiinien fosforylaatiota. Nämä tiedot osoittavat siis, että fragmentoituneet tai natiivit matriisiproteiinimolekyylit moduloivat kondrosyyttien metabolista toimintaa solukalvon reseptorien aktivaation kautta.
• Ruosyyttien matriisiproteiinisynteesin nopea stimulaatio entsyymien avulla voi olla seurausta kondrosyyttien muodon muutoksista ja/tai sytoskeleton uudelleenjärjestelystä.
• Jotkin sytokiinit (esim. IL-8) ja kasvutekijät (esim. IGF-1, TGF-β) eristyvät solukalvolle (ECM). Tunnetuin esimerkki on TGF-β:n sitoutuminen dekoriiniin, mikä johtaa TGF-β:n kyvyn heikkenemiseen indusoida solukasvua kiinanhamsterin munasarjasoluissa. Löydös, että dekoriinin pitoisuus rustossa kasvaa iän myötä, viittaa TGF-β:n biologisen hyötyosuuden vähenemiseen ikääntymisen myötä. Kasvutekijät ja sytokiinit voivat vapautua matriisijätteistä viljelyn aikana ja siten moduloida kondrosyyttien toimintaa.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Rudosyyttien yksikerroksinen viljelmä

Rudosyyttien erilaistuneelle fenotyypille on ensisijaisesti ominaista tyypin II kollageenin ja kudoskohtaisten proteoglykaanien synteesi sekä alhainen mitoottinen aktiivisuus. On näyttöä siitä, että pitkäaikaisessa soluviljelyssä yksikerroksisessa kerroksessa sekä useiden toistuvien solukulkujen jälkeen kondrosyytit menettävät pallomaiset ääriviivat ja saavat pitkänomaisen, fibroblastimaisen muodon. Tällaisessa fibroblastisessa metaplasiassa myös solujen synteettinen toiminta muuttuu, jolle on ominaista tyypin II, IX ja XI kollageenien synteesin asteittainen väheneminen ja tyypin I, III ja Y kollageenien synteesin lisääntyminen. Pieniä, aggregoitumattomia proteoglykaaneja syntetisoidaan toiminnallisen aggrekaanin ansiosta. Katepsiini B:n ja L:n synteesi on erittäin vähäistä erilaistuneissa soluissa, mutta lisääntyy erilaistumisen menetyksen prosessissa. Kollagenaasi-1:tä ilmentyy erilaistuneissa kondrosyyteissä; pitkäaikaisessa viljelyssä sen ilmentyminen vähenee, kun taas kudosmetalloproteaasien estäjien (TIMP) tuotanto lisääntyy.

Erilaistuneet kondrosyytit ilmentävät uudelleen erilaistuneen fenotyypin kollageenia, kun ne siirretään yksikerrosviljelmästä suspensioviljelmään. Erilaistumisprosessi liittyy todennäköisesti solun muotoon. Tätä ominaisuutta käyttävät säännöllisesti tutkijat, jotka tutkivat viallisia siirteitä autologisilla kondrosyyteillä. Pieni määrä biopsiamateriaalista saatuja soluja voidaan lisätä yksikerrosviljelmässä ja sitten viedä takaisin kolmiulotteiseen matriisiin ennen siirtoa. TGF-β, osseiini-hydroksiapatiittikompleksi ja askorbiinihappo voivat stimuloida spesifisen fenotyypin uudelleenilmentymistä agaroosiviljelmään siirretyissä erilaistumattomissa kondrosyyteissä.

Kasvutekijöiden ja sytokiinien vaikutuksesta kondrosyytit muuttuvat erilaistumisprosessin aikana. Soluvaste sytokiineille ja kasvutekijöille eroaa erilaistumattomien ja erilaistuneiden kondrosyyttien välillä. IL-1 stimuloi fibroblastien lisääntymistä, kun taas IL-1 estää erilaistumattomien kondrosyyttien kasvua. IGF-1 stimuloi DNA-synteesiä pitkänomaisissa, mutta ei litistyneissä kondrosyyteissä. Erilaistuneissa kondrosyyteissä IL-1beetan ja TNF-α:n stimuloivat prokollagenaasin tuotantoa voimakkaammin kuin erilaistumattomissa kondrosyyteissä.

Kondrosyyttien viljely

Rudosyyttien viljely suspensiossa nestemäisessä väliaineessa tai luonnollisessa tai synteettisessä kolmiulotteisessa matriisissa stabiloi kondrosyyttien fenotyyppiä. Solut säilyttävät pallomaisen muotonsa ja syntetisoivat kudoskohtaisia proteiineja. Rudosyyttien suspensioviljelyä suositellaan yleensä uuden perisellulaarisen matriisin muodostumisen tutkimiseen. Rudosyyttiviljelmiä synteettisissä tai luonnollisissa imukykyisissä polymeereissä käytetään solujen istuttamiseen rustovaurioihin nivelrustokudoksen uudistumisen stimuloimiseksi. Implantoitujen solujen synteettisen tai luonnollisen väliaineen on täytettävä useita vaatimuksia:

• implanttien on oltava huokoisia solujen kiinnittymisen ja kasvun varmistamiseksi,
• itse polymeerin tai sen hajoamistuotteiden ei tulisi aiheuttaa tulehdusta tai toksisia reaktioita, kun ne istutetaan in vivo -olosuhteissa,
• siirteen kantajan on kyettävä sitoutumaan viereiseen rustoon tai subkondraaliseen luuhun,
• luonnollisen tai synteettisen matriisin on kyettävä imeytymään, sen hajoamisen on oltava tasapainossa kudosten uudistumisen avulla,
• Ruston korjautumisen helpottamiseksi matriisin kemiallisen rakenteen ja huokosten arkkitehtuurin on helpotettava solufenotyypin ylläpitoa ja kudoskohtaisten proteiinien synteesiä siihen sijoitettujen kondrosyyttien avulla,
• In vivo -implantaation aikana on tarpeen tutkia synteettisen tai luonnollisen matriisin mekaanisia ominaisuuksia.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Rudosyyttien suspensio nestemäisessä faasissa

Solujen kiinnittyminen muovisiin astioihin, joissa kondrosyyttejä viljellään, voidaan estää päällystämällä niiden seinämät metyyliselluloosa-, agaroosi-, hydrogeeli- (poly-2-hydroksietyylimetakrylaatti) tai kollageeni-agaroosiseosliuoksella. Näissä olosuhteissa kondrosyytit muodostavat klustereita ja syntetisoivat pääasiassa aggrekaania ja kudoskohtaisia kollageeneja (tyypit II, IX, XI). Yleensä löytyy kahdenlaisia soluja. Keskellä sijaitsevat solut säilyttävät pallomaisen muodon ja niitä ympäröi hyvin kehittynyt solunulkoinen kalvo (ECM), mikä on vahvistettu histokemiallisilla ja ultrastruktuurisilla tutkimuksilla. Reunalla kondrosyyteillä on kiekkomaiset ääriviivat ja niitä ympäröi harva ECM; tällaisten solujen toiminnallisista ominaisuuksista tiedetään vähän.

Rudosyyttejä on mahdollista viljellä suspensiossa pidetyillä mikrokantajilla; mikrokantajina käytetään dekstraanihelmiä (cytodex), kollageenilla päällystettyjä dekstraanihelmiä (cytodex III) ja huokosettomia tyypin I kollageenin mikropalloja (sellageeni). Näissä viljelyolosuhteissa kondrosyytit kiinnittyvät mikrokantajan pintaan, säilyttävät pallomaisen muotonsa ja tuottavat matriisimaista materiaalia. Lisäksi cellageenin käyttö edistää kondrosyyttien lisääntymistä ja normaalin fenotyypin uudelleen ilmentymistä. Siksi kondrosyyttien viljely cellageenimikropalloilla voidaan käyttää solun fenotyypin palauttamiseen ennen elinsiirtoa.

Toinen menetelmä kondrosyyttisuspension viljelyyn nestemäisessä väliaineessa on niiden viljely tiheiden solupallojen muodossa (0,5-1 * 10 ^b ), jotka on saatu sentrifugoimalla. Tällaiset kondrosyytit kykenevät tuottamaan matriisin, joka sisältää suuren määrän proteoglykaaneja, tyypin II kollageenia, mutta ei tyypin I kollageenia, mikä on vahvistettu histologisilla, immunohistokemiallisilla ja kvantitatiivisilla menetelmillä.

Rudosyyttien suspensio luonnollisessa ECM:ssä

Kondrosyyttejä voidaan viljellä suspensiona kolmiulotteisessa matriisissa (pehmeä agar, agaroosi, kollageenigeeli tai -sieni, hyaluronihappo, fibriiniliima, alginaattihelmet).

Agaroosissa viljellyt kondrosyytit säilyttävät normaalin fenotyyppinsä ja syntetisoivat tyypin II kollageenia ja kudoskohtaisia aggrekaaniaggregaatteja. Agaroosissa viljeltynä solun syntetisoimat proteoglykaanit vapautuvat kasvatusalustaan 50 päivän ajan. Vertailun vuoksi yksikerroksisessa viljelmässä solufaasi on ylikuormittunut glykosaminoglykaaneilla jo viljelyn ensimmäisten 5–6 päivän aikana; kasvatusalustassa viljeltynä glykosaminoglykaanien lisääntyneen synteesin ja vapautumisen jälkeen ensimmäisten 8–10 päivän aikana niiden määrä vähenee ajasta riippuen. Rustosolujen käyttäytyminen agaroosissa viljeltynä eroaa kuitenkin in vivo -käyttäytymisestä. Agaroosissa suuri määrä syntetisoituja aggrekaaniaggregaatteja sisältää pienempiä molekyylejä ja vähemmän molekyylejä kuin in vivo. TGF-β stimuloi proteoglykaanisynteesiä eksplantaatissa, mutta vähentää aggrekaanisynteesiä agaroosissa.

Alginaatti on ruskeasta merilevästä saatu lineaarinen polysakkaridi. Kaksiarvoisten kationien, kuten Ca2 ⁺ -ionien, läsnä ollessa tästä polymeeristä tulee geeli. Jokainen alginaattiin vangittu kondrosyytti on ympäröity negatiivisesti varautuneiden polysakkaridien matriisilla, jonka huokoset ovat verrattavissa hyaliiniruston huokosiin. Ruosyyttien alginaattihelmissä muodostama matriisi koostuu kahdesta osastosta - ohuesta soluihin liittyvästä matriisikerroksesta, joka vastaa nivelruston perisellulaarista ja reviirimatriisia, ja kauempana olevasta matriisista, joka vastaa natiivin kudoksen interterritoriaalista matriisia. Viljelypäivänä 30. päivänä solujen ja kunkin kahden osaston käyttämä suhteellinen ja absoluuttinen tilavuus alginaattihelmessä on lähes täysin identtinen natiivin ruston kanssa. Lähes 30 päivän ajan kondrosyytit säilyttävät pallomaisen muotonsa ja tuottavat aggrekaania, jonka hydrodynaamiset ominaisuudet ovat samanlaiset kuin nivelrustomatriisin aggrekaanimolekyylien, sekä tyypin II, IX ja XI kollageenimolekyylejä. Samaan aikaan, kuten muissakin suspensioviljelmissä, alginaattihelmien pinnalla on litistyneitä soluja, jotka tuottavat pienen määrän tyypin I kollageenimolekyylejä, jotka vapautuvat suoraan kasvualustaan eivätkä liity solukalvoon (ECM). Alginaattihelmissä havaitaan kohtalaista kondrosyyttien lisääntymistä. Kahdeksan kuukauden alginaattigeelissä viljelyn jälkeen kypsät kondrosyytit eivät menetä metabolista aktiivisuuttaan ja jatkavat kudosspesifisen tyypin II kollageenin ja aggrekaanin syntetisointia.

H. Tanaka ym. (1984) tutkivat erilaisten luonnollisten molekyylien diffuusio-ominaisuuksia alginaatissa ja havaitsivat, että yli 70 kDa:n molekyylit eivät diffundoituneet alginaatin läpi. Siten soluviljely alginaatissa soveltuu matriisin biosynteesin säätelyn ja ECM-organisaation tutkimiseen. Alginaatissa viljeltyjen solujen saatavuus mahdollistaa peptidisäätelytekijöiden ja farmakologisten aineiden vaikutuksen tutkimisen transkriptionaalisella, posttranskriptionaalisella ja translationaalisella tasolla.

Rustosoluja viljellään myös tyypin I ja II kollageenikuitujen matriisissa. S. Nehrer ym. (1997) vertasivat koiran kondrosyyttien toimintaa huokoisissa kollageeni-proteoglykaanipolymeerimatriiseissa, jotka sisälsivät erityyppisiä kollageeneja. He havaitsivat merkittäviä eroja kollageenityyppejä I ja II sisältävissä kollageenimatriiseissa viljeltyjen kondrosyyttien biosynteettisen toiminnan morfologiassa. Tyypin II kollageenimatriisissa olevat solut säilyttivät pallomaisen muotonsa, kun taas tyypin I kollageenissa niillä oli fibroblastien kaltainen morfologia. Lisäksi tyypin II kollageenimatriisissa kondrosyytit tuottivat suuremman määrän glykosaminoglykaaneja. J. van Susante ym. (1995) vertasivat alginaatti- ja kollageeni (tyyppi I) -geelissä viljeltyjen kondrosyyttien ominaisuuksia. Kirjoittajat havaitsivat merkittävän solujen määrän kasvun kollageenigeelissä, mutta kuudennesta viljelypäivästä lähtien solut menettivät ominaisen fenotyyppinsä muuttuen fibroblastien kaltaisiksi soluiksi. Alginaattigeelissä havaittiin solujen määrän vähenemistä, mutta kondrosyytit säilyttivät normaalin fenotyyppinsä. Kollageenigeelissä proteoglykaanien määrä solua kohden oli merkittävästi suurempi kuin alginaatissa, mutta geelissä havaittiin matriisielementtien synteesin vähenemistä kuudennesta viljelypäivästä alkaen, kun taas alginaatissa synteesi jatkoi kasvuaan.

Kiinteä kolmiulotteinen fibriinimatriisi on luonnollinen aine, joka tukee siihen suspendoituneita kondrosyyttejä erilaistuneessa fenotyypissä. Kolmiulotteista fibriinimatriisia voidaan käyttää myös kantajana kondrosyyttien siirrossa. Fibriinin etuja ovat sytotoksisuuden puuttuminen, kyky täyttää tilaa ja adheesiokyky. Histologiset ja biokemialliset tutkimukset, autoradiografia ja elektronimikroskopia ovat osoittaneet, että fibriinigeelissä olevat kondrosyytit säilyttävät morfologiansa, lisääntyvät ja tuottavat matriisia jopa kahden viikon viljelyn jälkeen. G. Homminga ym. (1993) kuitenkin raportoivat, että fibriinin hajoaminen alkaa kolmen päivän viljelyn jälkeen ja kondrosyyttien dedifferentiaatio etenee.

Rudosyyttien suspensio keinotekoisessa (synteettisessä) ECM:ssä

Rekonstruktiiviseen tai ortopediseen kirurgiaan tarkoitettuja rustoimplantteja voidaan saada kasvattamalla eristettyjä kondrosyyttejä in vitro synteettisessä bioyhteensopivassa matriisissa.

Polyglykolihapossa viljellyt rustosolut lisääntyvät ja säilyttävät normaalin morfologian ja fenotyypin 8 viikon ajan. Rudosyytti-polyglykolihappo-kompleksi koostuu soluista, glykosaminoglykaaneista ja kollageeneista, ja sillä on ulkoinen kollageenikapseli. Tällaiset implantit sisältävät kuitenkin kahdenlaisia kollageenimolekyylejä - I ja II. Useiden läpikulkujen kautta dedifferentioituneista kondrosyyteistä peräisin olevissa implanteissa on suurempi määrä glykosaminoglykaaneja ja kollageeneja kuin ensisijaisesti erilaistumattomista kondrosyyteistä peräisin olevissa implanteissa.

L. Freed ym. (1993b) vertasivat ihmisen ja naudan kondrosyyttiviljelmien käyttäytymistä kuituisessa polyglykolihapossa (FPGA) ja huokoisessa polymaitohapossa (PPLA). 6–8 viikon naudan kondrosyyttien viljelyn jälkeen FPGA:ssa tai PPLA:ssa kirjoittajat havaitsivat solujen lisääntymistä ja rustomatriisin uudistumista. FPGA:ssa kondrosyyteillä oli pallomainen muoto ja ne sijaitsivat aukkoina rustomatriisin ympäröimänä. 8 viikon in vitro -viljelyn jälkeen regeneroitu kudos sisälsi jopa 50 % kuiva-ainetta (4 % solumassaa, 15 % glykosaminoglykaaneja ja 31 % kollageeneja). PPLA:ssa solut olivat karan muotoisia ja niissä oli pieni määrä glykosaminoglykaaneja ja kollageenia. FPGA:ssa solukasvu oli kaksi kertaa voimakkaampaa kuin PPLA:ssa. In vivo VPGK:ssa ja PPLC:ssä kasvatetut kondrosyytit tuottivat histologisesti rustoa muistuttavaa kudosta 1–6 kuukauden kuluessa. Implantit sisälsivät glykosaminoglykaaneja, tyypin I ja II kollageeneja.

Naudan sikiön kondrosyyttejä viljeltiin huokoisessa, suurtiheyksisessä hydrofobisessa ja hydrofiilisessä polyeteenissä. Seitsemän päivän inkuboinnin jälkeen molemmissa substraateissa solut säilyttivät pallomaisen muodon ja sisälsivät pääasiassa tyypin II kollageenia. 21 päivän viljelyn jälkeen hydrofiilisen matriisin havaittiin sisältävän enemmän tyypin II kollageenia kuin hydrofobisen matriisin.

Rustokudosta voidaan saada myös viljelemällä sitä yksikerroksisena kerroksena Millicell-CM-suodattimilla. Suodattimien esipinnoitus kollageenilla on välttämätöntä kondroitiinien kiinnittymiseksi. Viljelmän histologinen tutkimus osoittaa kondrosyyttien kertymistä solukalvoon (ECM), joka sisältää proteoglykaaneja ja tyypin II kollageenia. Tyypin I kollageenia ei havaittu tällaisessa viljelmässä. Saadun rustokudoksen kondrosyytit ovat muodoltaan pallomaisia, mutta kudoksen pinnalla ne ovat hieman litistyneitä. Vasta muodostuneen kudoksen paksuus kasvoi ajan myötä ja riippui solumonokerroksen alkuperäisestä tiheydestä. Optimaalisissa viljelyolosuhteissa rustokudoksen paksuus saavutti 110 μm, sen solujen ja kollageenin organisoituminen pinnallisiin ja syviin kerroksiin on samanlainen kuin nivelruston. ECM sisältää noin 3 kertaa enemmän kollageenia ja proteoglykaaneja. Kahden viikon viljelyn jälkeen havaittiin matriisin kertymistä, minkä ansiosta kudos voitiin erottaa suodattimesta ja käyttää elinsiirtoon.

Sims ym. (1996) tutkivat kondrosyyttien viljelyä polyetyleenioksidigeelissä, kapseloidussa polymeerimatriisissa, joka mahdollistaa suurten solumäärien siirtämisen injektiolla. Kuusi viikkoa injektion jälkeen atymisten hiirten ihonalaiskudokseen muodostui uutta rustoa, jolle oli morfologisesti ominaista valkoinen opaalinhohtoinen sävy, joka muistutti hyaliinirustoa. Histologiset ja biokemialliset tiedot osoittivat aktiivisesti lisääntyvien, solun ulkopuolista massaa (ECM) tuottavien kondrosyyttien läsnäolon.

Selitys

Rustokudoksen eksplantaatiota käytetään tutkimaan sen ana- ja kataboliaprosesseja, homeostaasin ylläpitoa, imeytymistä ja korjausta. Rustosiirränteiden rustosolut säilyttävät normaalin fenotyypin ja solukalvon koostumuksen, joka on samanlainen kuin nivelrustossa in vivo. Viiden päivän viljelyn jälkeen seerumin läsnä ollessa saavutetaan vakio synteesitaso ja luonnolliset hajoamisprosessit. Kudosresorptiota voidaan kiihdyttää sekä pääviljelmässä että viljelmässä lisäämällä seerumia käyttämällä useita aineita, kuten IL-IB:tä, TNF-a:aa, bakteerien lipopolysakkarideja, retinoiinihappojohdannaisia tai aktiivisia happiradikaaleja. Ruston korjautumisen tutkimiseksi sen vaurioita indusoidaan liukoisten tulehdusvälittäjien (H2O2 _,IL -1, TNF-a ) tai matriisin fyysisen repeämisen avulla.

Organotyyppinen viljelymenetelmä on malli in vitro -tutkimuksille, joissa tutkitaan eristettyjen ulkoisten tekijöiden vaikutusta kondrosyytteihin ja ympäröivään matriisiin. In vivo kondrosyytit sijaitsevat harvaan solukalvossa (ECM) eivätkä ole kosketuksissa toisiinsa. Nivelruston eksplantaattiviljely säilyttää tämän rakenteellisen organisaation sekä kondrosyyttien ja ympäröivän solunulkoisen ympäristön väliset erityiset vuorovaikutukset. Tätä mallia käytetään myös tutkimaan mekaanisen rasituksen, farmakologisten aineiden, kasvutekijöiden, sytokiinien ja hormonien vaikutuksia ruston aineenvaihduntaan.

Rustokudoksen poiston toinen etu on se, ettei kondrosyyttejä vahingoiteta proteolyyttisten entsyymien tai mekaanisten tekijöiden vaikutuksesta, mikä on väistämätöntä soluja eristettäessä. Reseptorit ja muut kalvoproteiinit ja glykoproteiinit ovat suojattuja vahingollisilta tekijöiltä.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Chondronin kulttuuri

Kondroni on nivelruston rakenteellinen, toiminnallinen ja metabolinen yksikkö, joka koostuu kondrosyytistä, sen solunsisäisestä matriisista ja tiiviistä rihmamaisesta kapselista ja vastaa matriisin homeostaasista. Kondronit erotetaan mekaanisesti rustosta ja kerätään useilla peräkkäisillä hidasnopeuksisilla homogenisaatioilla. Eri rustosyvyyksiltä eristetyt kondronit voidaan jakaa neljään luokkaan: yksittäinen kondroni, parittaiset kondronit, useat (kolme tai useampia) lineaarisesti järjestäytyneet kondronit (kondronipylväät) ja kondroniryppäät.

Yksittäisiä kondroneja löytyy yleensä ehjän ruston keskikerroksista, parillisia kondroneja löytyy keski- ja syvien kerroksien rajalta, ja lineaarisesti järjestyneet useat kondronit ovat tyypillisiä ehjän ruston syville kerroksille. Lopuksi, kondroniryppäät koostuvat satunnaisesti järjestyneistä yksittäisten ja parillisten kondronien ryhmistä, jotka säilyttävät aggregoituneen tilansa homogenisoinnin jälkeen. Kondroniryppäät ovat suuria rustonpalasia, jotka yleensä sisältävät useita kondroneja ja säteittäisesti järjestettyjä kollageenifibrillejä, eli tyypillisen matriisin syville kerroksille ominaisen organisaation. Kondronit on immobilisoitu läpinäkyvään agaroosiin, mikä mahdollistaa niiden rakenteen, molekyylikoostumuksen ja metabolisen aktiivisuuden tutkimisen. Kondroni-agaroosijärjestelmää pidetään ruston mikromallina, joka eroaa perinteisestä kondrosyytti-agaroosijärjestelmästä siinä, että luonnollinen mikroympäristö säilyy, eikä sitä tarvitse syntetisoida ja koota. Kondroniviljelmä on malli solujen ja matriisin vuorovaikutusten tutkimiseen nivelrustossa normaaleissa ja patologisissa olosuhteissa.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Kuolemattomien kondrosyyttien viljely

Pysyvien solulinjojen luomiseen käytetään rekombinantti-DNA:ta tai onkogeeniä sisältäviä viruksia, jotka kykenevät tekemään solusta "kuolemattoman". Kuolemattomilla kondrosyyteillä on kyky lisääntyä loputtomasti säilyttäen samalla vakaan fenotyypin. F. Mallein-Gerin ym. (1995) osoittivat, että SV40T-onkogeeni indusoi hiiren kondrosyyttien lisääntymistä, jotka jatkavat stabiilia kollageenityyppien II, IX ja XI sekä nivelaggrekaanin ja sitovan proteiinin ilmentymistä. Tällainen solulinja saa kuitenkin kyvyn syntetisoida kollageenityyppiä I, kun sitä viljellään yksikerroksisessa viljelmässä tai agaroosigeelissä.

W. Horton ym. (1988) kuvasivat kuolemattomien solujen linjan, jolla oli alhainen tyypin II kollageenin mRNA:n ilmentymistaso. Nämä solut saatiin transformoimalla ne hiiren retroviruksella, joka sisälsi I-myc- ja y-ra-onkogeenejä. Tämän tyyppiset solut edustavat ainutlaatuista mallia nivelmatriisin vuorovaikutusten tutkimiseen tyypin II kollageenin puuttuessa, sekä tyypin II kollageenisynteesin säätelyn tutkimiseen.

Mutatoituneita tai deletoituja geenejä sisältävien kondropriittien viljely on kätevä malli niiden fysiologisen toiminnan tutkimiseen. Tämä malli soveltuu erityisesti tiettyjen molekyylien roolin tutkimiseen rustomatriisin organisaatiossa tai erilaisten säätelytekijöiden vaikutusten tutkimiseen ruston aineenvaihduntaan. Rustosolut, joista on deletoitu tyypin IX kollageenin geeni, syntetisoivat normaalia leveämpiä kollageenifibrillejä, mikä osoittaa, että tyypin IX kollageeni säätelee fibrillien halkaisijaa. Kuten luvussa 1 todettiin, tyypin II kollageenia koodaavassa COLAI-geenissä on äskettäin löydetty mutaatio primaarista yleistynyttä nivelrikkoa sairastavilla perheillä. Tutkiakseen mutanttityypin II kollageenin vaikutusta nivelmatriisiin, R. Dharmrvaram et al. (1997) transfektoivat (vieraalla nukleiinihapolla infektoituja) viallisia COL2AI- _geenejä (arginiini kohdassa 519 on korvattu kysteiinillä) ihmisen sikiön kondrosyyteihin in vitro.

Yhteisviljelyjärjestelmä. Nivelessä rusto on vuorovaikutuksessa muiden solutyyppien kanssa, joita on nivelkalvossa, nivelnesteessä, nivelsiteissä ja subkondraalisessa luussa. Rustosolujen aineenvaihduntaan voivat vaikuttaa useat näiden solujen syntetisoimat liukoiset tekijät. Niveltulehduksessa nivelrustoa tuhoavat proteolyyttiset entsyymit ja nivelkalvosolujen tuottamat vapaat radikaalit. Siksi on kehitetty malleja ruston ja ympäröivien kudosten välisten monimutkaisten vuorovaikutusten tutkimiseksi, joita kutsutaan yhteisviljelmiksi.

S. Lacombe-Gleise ym. (1995) viljelivät kaniinin kondrosyyttejä ja osteoblasteja yhteisviljelyjärjestelmässä (COSTAR), jossa solut erotettiin toisistaan mikrohuokoisella kalvolla (0,4 μm), mikä mahdollisti solujen vaihdon kahden solutyypin välillä ilman suoraa kosketusta. Tämä tutkimus osoitti osteoblastien kyvyn stimuloida kondrosyyttien kasvua liukoisten välittäjäaineiden kautta.

AM Malfait ja yhteistyökumppanit (1994) tutkivat perifeerisen veren monosyyttien ja kondrosyyttien välistä suhdetta. Tämä malli soveltuu hyvin sytokiinivälitteisten prosessien tutkimiseen tulehduksellisissa nivelsairauksissa (nivelreuma, seronegatiiviset spondyloartriitit jne.). Mallin tekijät erottivat solut proteiineja sitovalla kalvolla, jonka huokosten halkaisija oli 0,4 μm. Tutkimus osoitti, että lipopolysakkaridilla stimuloidut monosyytit tuottivat IL-1:tä ja TNF-a:aa, jotka estivät aggrekaanin synteesiä kondrosyyteissä ja edistivät jo syntetisoitujen aggrekaaniaggregaattien hajoamista.

K. Tada ym. (1994) loivat yhteisviljelymallin, jossa kollageenigeelissä (tyyppi I) olevat endoteelisolut sijoitettiin sisäkammioon, joka oli erotettu ulkokammiosta suodattimella, jonka huokoskoko oli 0,4 μm. Täysin ulkokammiosta eristyksissä ihmisen endoteelisolut muodostivat putkia kollageenigeelissä EGF:n tai TGF-α:n läsnä ollessa. Kun molempia solutyyppejä viljeltiin samanaikaisesti, endoteelisolujen TGF-α:sta riippuvainen putkien muodostuminen estyi. Tämän prosessin esto kondrosyyteissä eliminoitiin osittain anti-TGF-beeta-vasta-aineilla. Voidaan olettaa, että kondrosyyttien tuottama TGF-beeta estää itse ruston verisuonittumista.

S. Groot ym. (1994) viljelivät samanaikaisesti 16 päivän ikäisen hiiren sikiön luun hypertrofisista ja proliferatiivisista vyöhykkeistä peräisin olevia kondrosyyttejä aivokudospalojen kanssa. Neljän päivän viljelyn jälkeen havaittiin kondrosyyttien transdifferentiaatio osteoblasteiksi ja osteoidin muodostumisen alku. 11 päivän viljelyn jälkeen osa rustosta oli korvautunut luukudoksella ja luumatriisi oli osittain kalkkeutunut. Jotkut aivokudoksen tuottamat neuropeptidit ja välittäjäaineet vaikuttavat osteoblastien aineenvaihduntaan tai niillä on reseptoreita niille. Näitä ovat noradrenaliini, vasoaktiivinen suolistopeptidi, kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi, substanssi P ja somatostatiini. Yhdessä kondrosyyttien kanssa viljellyt aivokudospalat voivat tuottaa joitakin luetelluista tekijöistä, jotka kykenevät indusoimaan kondrosyyttien transdifferentiaatioprosessin osteoblasteiksi.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Ulkoisten tekijöiden vaikutus kondrosyyttiviljelmään

Happijännityksen vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan

Useimmissa tapauksissa kondrosyyttiviljelmät kehittyvät ilmakehän happipaineen olosuhteissa. On kuitenkin hyvin tunnettua, että in vivo -kondrosyytit esiintyvät hypoksisissa olosuhteissa ja happipaine vaihtelee erilaisissa patologisissa olosuhteissa. Kypsymisprosessin aikana havaitaan merkittäviä muutoksia epifyysien verenkierrossa. Koska verisuonittuminen vaihtelee kasvulevyn eri alueilla, myös niiden happipaine vaihtelee. C. Brighton ja R. Heppenstall (1971) osoittivat, että kanien sääriluulevyssä happipaine hypertrofisella vyöhykkeellä on pienempi kuin ympäröivässä rustossa. Joidenkin aineenvaihduntaparametrien mittaukset osoittivat, että kondrosyytit pystyvät reagoimaan nopeasti paikallisiin happipitoisuuden muutoksiin. Ensinnäkin alhaisella happipaineella kondrosyyttien sen kulutus vähenee. Happipaineen laskiessa 21 prosentista 0,04 prosenttiin glukoosin käyttö lisääntyy, glykolyyttisten entsyymien aktiivisuus ja maitohapon synteesi lisääntyvät. Jopa alhaisella happipaineella ATP:n, ADP:n ja AMP:n absoluuttinen määrä pysyy vakaana. Nämä tiedot osoittavat, että kondrosyyttien aineenvaihdunnassa pyritään maksimaaliseen energiansäästöön. Synteettinen aktiivisuus ja siten korjausprosessit kuitenkin muuttuvat hypoksisissa olosuhteissa.

Korkea happipaine vaikuttaa myös kondrosyyttien aineenvaihduntaan, aiheuttaen proteoglykaanien ja DNA:n synteesin vähenemistä sekä rustomatriisin hajoamista. Näihin vaikutuksiin liittyy yleensä vapaiden happiradikaalien tuotantoa.

Ympäristön ionipitoisuuden ja osmoottisen paineen vaikutus kondrosyyttien toimintaan

Luonnollisessa rustossa ionien pitoisuus eroaa merkittävästi muista kudoksista: natriumin pitoisuus solunulkoisessa väliaineessa on 250–350 mmol ja sen osmolaarisuus on 350–450 mosmol. Kun kondrosyytit eristetään solunulkoisesta massasta (ECM) ja inkuboidaan standardiväliaineessa (DMEM (Dulbeccon minimaalinen välttämätön väliaine), osmolaarisuus on 250–280,7 mosmol), solujen ympäröivä ympäristö muuttuu dramaattisesti. Lisäksi kalsiumin ja kaliumin pitoisuudet standardiväliaineessa ovat merkittävästi alhaisemmat kuin luonnollisessa kudoksessa, ja anionien pitoisuus on merkittävästi korkeampi.

Sakkaroosin lisääminen elatusaineeseen lisää sen osmolaarisuutta ja indusoi ohimenevän solunsisäisen H ^+- ja kalsiumanionien pitoisuuden nousun sytosolissa. Tällaiset solunsisäiset muutokset voivat vaikuttaa kondrosyyttien erilaistumisprosesseihin ja niiden metaboliseen aktiivisuuteen. J. Urban ym. (1993) havaitsivat, että eristettyjen kondrosyyttien, joita inkuboitiin standardissa DMEM-elatusaineessa 2–4 tuntia, 35S-sulfaatin ja 3H-proliinin sisäänotto ^oli vain ¹⁰ % natiivin kudoksen osmolaarisuuteen verrattuna. Synteesin intensiteetti saavutti maksiminsa solunulkoisen elatusaineen osmolaarisuuden ollessa 350–400 mosmol sekä tuoreissa eristetyissä kondrosyyteissä että rustokudossiirteissä. Lisäksi kondrosyyttien tilavuus kasvoi 30–40 % sen jälkeen, kun eristetyt solut oli asetettu määritetyn osmolaarisuuden omaavaan standardiin DMEM-elatusaineeseen. Kuitenkin, kun kondrosyyttejä viljellään ei-fysiologisessa osmolaarisuuden olosuhteissa 12–16 tuntia, solut sopeutuvat uusiin olosuhteisiin vähentäen biosynteesin intensiteettiä suhteessa solunulkoisen ympäristön osmolaarisuuden muutokseen.

P. Borgetti ym. (1995) tutkivat solunulkoisen väliaineen osmolaarisuuden vaikutusta sian kondrosyyttien kasvuun, morfologiaan ja biosynteesiin. Kirjoittajat osoittivat samanlaisia biokemiallisia ja morfologisia ominaisuuksia kondrosyyteillä, joita viljeltiin 0,28 ja 0,38 mosmol:n osmolaarisuuden omaavissa elatusaineissa. Keskimääräisellä 0,48 mosmol:n osmolaarisuuden omaavalla elatusaineella havaittiin solujen lisääntymisen ja proteiinisynteesin vähenemistä viljelyn ensimmäisten 4–6 tunnin aikana, mutta nämä parametrit palautuivat myöhemmin ja lopulta saavuttivat kontrolliarvot. Kun kondrosyyttejä viljeltiin 0,58 mosmol:n osmolaarisuuden omaavalla elatusaineella, solut menettivät kyvyn ylläpitää proliferatiivisten prosessien fysiologista intensiteettiä, ja 6 päivän kuluttua kondrosyyttien määrä väheni merkittävästi. Keskimääräisellä 0,58 mosmol:n osmolaarisuuden omaavalla elatusaineella havaittiin merkittävä proteiinisynteesin estyminen. Lisäksi 0,28–0,38 mOsm:n osmolaarisuuden omaavalla elatusaineella viljeltyinä kondrosyytit säilyttävät fysiologisen fenotyyppinsä; Korkeammalla osmolaarisuustasolla (0,48–0,58 mOsm) solumorfologiassa tapahtuu merkittäviä muutoksia, jotka ilmenevät ominaisen fenotyypin katoamisena, kondrosyyttien muuttumisena fibroblastien kaltaisiksi soluiksi ja solujen kyvyn heikkenemisenä koota matriisiproteoglykaaneja. Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat kondrosyyttien kyvyn reagoida solunulkoisen ympäristön osmolaarisuuden rajoitettuihin vaihteluihin.

Myös muiden ionien pitoisuuksien muutokset voivat vaikuttaa kondrosyyttien biosynteesiprosesseihin. Siten 35S ^: n (sulfaatin) liittymisaste puolittuu kaliumionien pitoisuuden kasvaessa 5 mmol:sta (pitoisuus standardissa DM EM -elatusaineessa) 10 mmol:iin (pitoisuus ECM:ssä in vivo). Alle 0,5 mmol:n kalsiumpitoisuudet edistivät kollageenin tuotantoa kypsillä nautakondrosyyteillä, kun taas 1–2 mmol:n pitoisuus (vastaa pitoisuutta standardissa DM EM -elatusaineessa) aiheutti merkittävän kollageenisynteesin vähenemisen. Korkeilla kalsiumpitoisuuksilla (2–10 mmol) havaittiin kohtalainen biosynteesin lisääntyminen. Useat kationit osallistuvat kondrosyyttien kiinnittymiseen ECM-proteiineihin. Siten magnesium- ja mangaani-ionit varmistavat kiinnittymisen fibronektiiniin ja tyypin II kollageeniin, kun taas kalsiumionit eivät osallistu kondrosyyttien kiinnittymiseen proteiineihin. Näin ollen kuvattujen tutkimusten tulokset osoittavat kalium-, natrium- ja kalsiumionien sekä elatusaineen osmolaarisuuden muutosten vaikutuksen standardissa elatusaineessa inkuboitujen kondrosyyttien biosynteettiseen toimintaan.

Mekaanisen rasituksen vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan

Nivelen immobilisaatio aiheuttaa palautuvaa ruston surkastumista, mikä osoittaa mekaanisten ärsykkeiden tarvetta normaaleille aineenvaihduntaprosesseille solukalvossa (ECM). Useimmissa tapauksissa käytetyt soluviljelymallit toimivat normaalissa ilmakehän paineessa. M. Wright ym. (1996) osoittivat, että mekaaninen ympäristö vaikuttaa kondrosyyttien aineenvaihduntaan, soluvaste riippuu puristuskuormituksen voimakkuudesta ja taajuudesta. Kokeet, joissa kuormitettiin ehjää nivelrustoa sisältäviä eksplantteja in vitro, osoittivat proteiinien ja proteoglykaanien synteesin vähenemistä staattisen kuormituksen vaikutuksesta, kun taas dynaaminen kuormitus stimuloi näitä prosesseja. Mekaanisen kuormituksen tarkat vaikutusmekanismit rustoon ovat monimutkaisia ja liittyvät todennäköisesti solujen muodonmuutokseen, hydrostaattiseen paineeseen, osmoottiseen paineeseen, sähköpotentiaaliin ja matriisimolekyylien pinnan solureseptoreihin. Näiden parametrien vaikutuksen tutkimiseksi on tarpeen luoda järjestelmä, jossa yhtä parametria voidaan vaihdella itsenäisesti. Esimerkiksi eksplantaattiviljely ei sovellu solujen muodonmuutoksen tutkimiseen, mutta sitä voidaan käyttää tutkimaan paineen yleistä vaikutusta kondrosyyttien aineenvaihduntatoimintaan. Ruston puristuminen johtaa solujen muodonmuutokseen, ja siihen liittyy myös hydrostaattisen paineen gradientin, sähköpotentiaalin, nesteen virtauksen ja fysikaalis-kemiallisten parametrien, kuten matriisin vesipitoisuuden, sähkövaraustiheyden ja osmoottisen paineen, muutokset. Solujen muodonmuutosta voidaan tutkia käyttämällä eristettyjä kondrosyyttejä, jotka on upotettu agaroosiin tai kollageenigeeliin.

Useita järjestelmiä on kehitetty tutkimaan mekaanisen stimulaation vaikutusta kondrosyyttiviljelmään. Jotkut tutkijat käyttävät järjestelmiä, joissa soluviljelmään kohdistetaan painetta kaasufaasin kautta. Niinpä JP Veldhuijzen ym. (1979) havaitsivat cAMP:n ja proteoglykaanien synteesin lisääntymistä ja DNA-synteesin vähenemistä käyttämällä 13 kPa ilmakehän painetta korkeampaa painetta matalalla taajuudella (0,3 Hz) 15 minuutin ajan. R. Smith ym. (1996) osoittivat, että naudan primaaristen kondrosyyttiviljelmän ajoittainen altistaminen hydrostaattiselle paineelle (10 MPa) 1 Hz:n taajuudella 4 tunnin ajan lisäsi aggrekaanien ja tyypin II kollageenin synteesiä, kun taas vakiopaine ei vaikuttanut näihin prosesseihin. Käyttäen samanlaista järjestelmää Wright ym. (1996) raportoivat, että syklinen paine soluviljelmään liittyy kondrosyyttisolukalvon hyperpolarisaatioon ja Ca2 ⁺ -riippuvaisten kaliumkanavien aktivoitumiseen. Siten syklisen paineen vaikutukset välittyvät kondrosyyttikalvon venytysaktivoitujen ionikanavien kautta. Rudosyyttien vaste hydrostaattiseen paineeseen riippuu soluviljelyolosuhteista ja käytetyn kuormituksen taajuudesta. Siten syklinen hydrostaattinen paine (5 MPa) vähentää sulfaatin kertymistä kondrosyyttimonosolukerrokseen taajuuksilla 0,05, 0,25 ja 0,5 Hz, kun taas yli 0,5 Hz:n taajuudella sulfaatin kertyminen rustoeksplanttiin lisääntyy.

M. Bushmann ym. (1992) raportoivat, että agaroosigeelien kondrosyytit muuttavat biosynteesiä staattisen ja dynaamisen mekaanisen kuormituksen vaikutuksesta samalla tavalla kuin viljelty ehjä elin. Kirjoittajat havaitsivat, että mekaaninen kuormitus aiheuttaa hyperosmoottisen ärsykkeen, joka johtaa kondrosyyttien pH-arvon laskuun.

Mekaanisen venytyksen vaikutusta voidaan tutkia geeliin upotettuun soluviljelmään. Venytysvoima voidaan luoda tietokoneohjatulla tyhjiöllä. Kun järjestelmä on tietyssä tyhjiössä, petrimaljan pohja soluviljelmän kanssa pidennetään tunnetulla määrällä. Muodonmuutos on suurimmillaan maljan pohjan reunoilla ja pienimmillään keskellä. Venytys välittyy myös petrimaljassa viljeltyihin kondrosyytteihin. Tällä menetelmällä K. Holm-vall ym. (1995) osoittivat, että kollageenigeelissä (tyyppi II) viljellyissä kondrosarkoomasoluissa α2-integriinin mRNA:n ilmentyminen lisääntyy _{. β2-integriini} pystyy _sitoutumaan tyypin II kollageeniin. Sitä pidetään mekanoreseptorina, koska se vuorovaikuttaa aktiinia sitovien proteiinien kanssa ja yhdistää siten ECM:n ja sytoskeleton.

PH:n vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan

Rustokudoksen soluvälinesteen pH on happamampi kuin muissa kudoksissa. A. Maroudas (1980) määritti nivelrustomatriisin pH:ksi 6,9. B. Diamant ym. (1966) havaitsivat pH:n olevan 5,5 patologisissa olosuhteissa. On tunnettua, että kondrosyytit elävät alhaisessa hapenpolttoainepitoisuudessa (PO2), mikä osoittaa glykolyysin (95 % kaikesta glukoosimetaboliasta) tärkeän roolin näiden solujen aineenvaihdunnassa; glykolyysiin liittyy suuren maitohappomäärän tuotanto.

Glykolyysituotteiden aiheuttaman ympäristön happamoitumisen lisäksi matriisikomponenteilla itsellään on suuri merkitys. Proteoglykaanien suuri määrä kiinteää negatiivista varausta muuttaa solunulkoista ionikoostumusta: havaitaan korkea vapaiden kationien pitoisuus (esim. H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) ja matala anionien pitoisuus (esim. O2, HCO3). Lisäksi mekaanisen kuormituksen vaikutuksesta vettä poistuu solunulkoisesta massasta (ECM), mikä johtaa kiinnittyneiden negatiivisten varausten pitoisuuden kasvuun ja useampien kationien vetäminen matriisiin. Tähän liittyy solunulkoisen ympäristön pH:n lasku, mikä vaikuttaa solunsisäiseen pH:hon ja siten muuttaa kondrosyyttien aineenvaihduntaa. R. Wilkin ja A. Hall (1995) tutkivat solunulkoisen ja solunsisäisen ympäristön pH:n vaikutusta matriisin biosynteesiin eristettyjen nautaeläinten kondrosyyttien avulla. He havaitsivat matriisin synteesin kaksoismodifikaation pH:n laskun myötä. PH:n lievä lasku (7,4 < pH < 7,1) 50 %:lla lisäsi 35SO4:n ja 3H-proliinin liittymistä ^{kondrosyytteihin}_, kun taas ^alustan syvempi happamointi (pH < 7,1) esti synteesiä 75 %:lla kontrolliin verrattuna. Alhaisen pH:n (6,65) luominen ammoniumioneilla aiheutti matriisisynteesin vähenemisen vain 20 %. Saadut tulokset osoittavat, että matriisisynteesin solunulkoisen väliaineen pH:n muutosta ei voida selittää pelkästään solunsisäisen väliaineen pH:n muutoksilla. Lisäksi kondrosyyteillä on kyky säädellä solunsisäistä pH:ta Na ^+- ja H ⁺ -vaihtimen, Ka ⁺ -riippuvaisen Cl_ ^- НСОС3-kuljettajan ja H ⁺ /ATPaasin avulla.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Viljelyalustan koostumuksen vaikutus kondrosyyttien aineenvaihduntaan

Kondrosyyttien viljelyalustan on vastattava koeolosuhteita. Viime vuosina vasikan seerumia on käytetty viljelyolosuhteiden optimointiin. Seerumia käytettäessä on kuitenkin otettava huomioon useita tärkeitä seikkoja:

• solujen kasvu ulospäin kudoksen reunoista elinviljelmissä,
• eri sarjojen seerumien koostumuksen vaihtelu,
• tuntemattomien komponenttien läsnäolo niissä,
• lisääntynyt häiriöiden ja artefaktien riski tutkittaessa erilaisten biologisten tekijöiden vaikutusta solujen aineenvaihduntaan.

Esimerkki jälkimmäisestä on tutkimus EGF:n vaikutuksesta rottien ruston kondrosyytteihin. EGF stimuloi ^3H -tymidiinin liittymistä elimistöön ja DNA-pitoisuuden kasvua viljelmässä. Tämä vaikutus oli voimakkaampi pienillä seerumipitoisuuksilla (<1 %), mutta suurilla pitoisuuksilla (>7,5 %) vaikutus katosi.

On hyvin tunnettua, että vasikanseerumilla täydennettyssä DMEM-viljelyalustassa synteesi- ja hajoamistasot ovat merkittävästi koholla verrattuna in vivo -olosuhteisiin. Erot in vivo- ja in vitro -metabolian välillä voivat johtua nivelnesteen ja solujen viljelyalustan eroista. Lee ym. (1997) viljelivät nuoria nautasolukondrosyyttejä agaroosissa käyttäen ravintoalustaa, joka sisälsi 20 % vasikanseerumilla täydennettyä DMEM-viljelyalustaa ja suurta määrää normaalia allogeenista nivelnestettä. Nivelnesteen läsnäolo alustassa lisäsi proteoglykaanien määrää jopa 80 %:iin nivelnesteen kokonaismäärästä. Nämä tulokset osoittavat, että nivelneste viljelmässä indusoi samanlaisen aineenvaihdunnan kuin in vivo, glykosaminoglykaanien synteesin ollessa korkeaa ja solujen jakautumisen vähäistä.

G. Verbruggen ym. (1995) osoittivat, että agaroosissa seerumittomassa DMEM-elatusaineessa viljeltyjen ihmisen kondrosyyttien ^35S -arrpeKaHa-synteesi oli 20–30 % 10 % vasikan seerumilla täydennettynä DMEM-elatusaineessa havaitusta synteesitasosta. Kirjoittajat määrittivät, missä määrin IGF-1, IGF-2, TGF-R tai insuliini palauttivat aggrekaanien tuotannon seerumittomassa elatusaineessa. Kirjoittajat totesivat, että 100 ng/ml insuliinia, IGF-1:tä tai IGF-2:ta palauttivat osittain aggrekaanien synteesin 39–53 %:iin kontrollitasosta. Synergismiä tai kumulaatiota ei havaittu lueteltujen tekijöiden yhdistelmällä. Samaan aikaan 10 ng/ml TGF-R 100 ng/ml insuliinin läsnä ollessa stimuloi aggrekaanien synteesiä 90 %:iin tai enemmän vertailutasosta. Lopuksi, ihmisen seerumin transferriini, yksinään tai yhdessä insuliinin kanssa, ei vaikuttanut aggrekaanien synteesiin. Kun vasikan seerumi korvattiin naudan seerumin albumiinilla, aggrekaaniaggregaattien pitoisuus laski merkittävästi. Viljelyalustan rikastaminen insuliinilla, IGF:llä tai TGF-R:llä palautti osittain solujen kyvyn tuottaa aggrekaaniaggregaatteja. Lisäksi IGF-1 ja insuliini pystyvät ylläpitämään homeostaasia soluviljelmissä. 40 päivän viljelyn jälkeen 10–20 ng/ml IGF-1:llä rikastetussa alustassa proteoglykaanisynteesi pysyi samalla tasolla tai jopa korkeampana verrattuna 20 % vasikan seerumia sisältävään alustaan. Kataboliset prosessit etenivät hitaammin IGF-1:llä rikastetussa alustassa kuin 0,1 % albumiiniliuoksella rikastetussa alustassa, mutta jonkin verran nopeammin 20 % seerumilla rikastetussa alustassa. Pitkäikäisissä viljelmissä 20 ng/ml IGF-1 ylläpitää solujen vakaata tilaa.

D. Lee ym. (1993) vertasivat viljelyalustan koostumuksen (DMEM, DMEM+20 % vasikan seerumia, DMEM+20 ng/ml IGF-1) vaikutusta DNA-synteesiin rustokudossiirreviljelmässä, yksikerrosviljelmässä ja agaroosisuspensiossa. Seerumin läsnä ollessa agaroosissa viljeltyjen solujen taipumusta ryhmittyä suuriksi klustereiksi havaittiin. Ilman seerumia tai IGF-1:n kanssa viljellyt solut säilyttivät pyöreän muotonsa agaroosissa, ne kerättiin pieniksi ryhmiksi, mutta eivät muodostaneet suuria aggregaatteja. Yksikerrosviljelmässä DNA-synteesi oli merkittävästi korkeampaa seerumia sisältävässä alustassa kuin IGF-1:llä rikastetussa alustassa; jälkimmäisessä DNA-synteesi oli merkittävästi korkeampaa kuin rikastamattomassa alustassa. DNA-synteesissä ei havaittu eroja, kun kondrosyyttejä viljeltiin agaroosisuspensiossa rikastamattomassa alustassa ja IGF-1:tä sisältävässä alustassa. Samaan aikaan kondrosyyttisuspensioiden viljely agaroosissa seerumilla rikastetussa elatusaineessa haihtui radionukleotidi ^3H -tymidiinin lisääntyneeseen liittymiseen verrattuna muihin elatusaineisiin.

C-vitamiini on välttämätön kollageenifibrillien stabiilin kierrerakenteen muodostumiseen osallistuvien entsyymien aktivoitumiselle. Askorbiinihapon puutteesta kärsivät rustosolut syntetisoivat alihydroksyloituneita ei-kierremaisia kollageenin esiasteita, jotka erittyvät hitaasti. Askorbiinihapon (50 μg/ml) anto aiheuttaa kollageenityyppien II ja IX hydroksylaation ja niiden erityksen normaaleina määrinä. C-vitamiinin lisääminen ei vaikuttanut proteoglykaanisynteesin tasoon. Siksi kollageenin eritystä säädellään proteoglykaanien erityksestä riippumatta.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]