Kokeellinen työ allogeenisten keratinosyyttien siirtämisestä valkoisten rottien keinotekoisesti luotuihin arpiin.

Halu hyödyntää solupotentiaalia ja tarve löytää uusia tehokkaita menetelmiä arpien esteettisen ulkonäön parantamiseksi johti ajatukseen yrittää tutkia keratinosyyttien siirtämisen mahdollisuutta arven pinnoille.

Keratinosyyttiviljelyn todennäköisyyden osoittamiseksi arpien ulkonäön parantamiseksi tehtiin kokeellinen tutkimus valkoisilla laboratoriorotilla, joille luotiin arpipintoja. Rotan arpimalli saatiin parantamalla keinotekoisesti selkään selkärankaa pitkin aiheutettuja haavoja. Rotista leikattiin identtisiä, 2 x 3 cm:n kokoisia ihopaloja. 2,5 kuukautta "arvenmallinnus"-leikkauksen jälkeen rotille tehtiin dermabrasio (arven pintakerrosten poisto termokaustisella menetelmällä) ja allogeenisia keratinosyyttejä siirrettiin rotanpoikasten iholta 2–4 päivää syntymän jälkeen.

Rotan epidermaalisten solujen eristäminen ja viljely suoritettiin Venäjän tiedeakatemian sytologian instituutin soluteknologian laboratoriossa käyttäen seuraavaa tekniikkaa.

Iho pestiin Hankin suolaliuoksella, joka sisälsi 200 U/ml gentamisiinia, ja leikattiin pieniksi paloiksi, joiden pinta-ala oli 0,2–0,5 cm2 ^. Ihopaloja inkuboitiin 0,5 % dispaasiliuoksessa tasapainotetussa suolafosfaattipuskuroidussa liuoksessa 37 °C:ssa yhden tunnin ajan. Sitten palat siirrettiin Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen ja epidermis erotettiin dermiksestä. Epidermisiä inkuboitiin 0,125 % trypsiiniliuoksessa 10–15 minuuttia sekoittaen nopeudella 50 rpm, minkä jälkeen entsyymin toiminta pysäytettiin lisäämällä 5 % naudan sikiön seerumia. Kolmasosa saadusta solususpensiosta käytettiin puhtaassa muodossa yhteen vaihtoehdoista arpisiirtoon, toinen kolmannes kasvatettiin bioyhteensopiville kotimaisille "Polypor"-kalvopinnoitteille ja kolmas petrimaljoilla ilman substraattia. Tuloksena olevien arpien dermabrasioleikkaus rotilla ja sen jälkeen rotan epidermiksen solujen siirto niille suoritettiin eetterianestesiassa käyttäen lämpöpolttoainetta.

Ensimmäisessä rottaryhmässä dermabrasion jälkeen steriilejä batistikappaleita asetettiin kiillotetulle, fysiologisella liuoksella pestylle ja kuivatulle arven pinnalle, jolle levitettiin ravistettua allogeenisten rotan epidermosyyttien suspensiota pitoisuutena 1,5 miljoonaa solua per 1 ml (Sytologian instituutin mukaan). Batistikappaleet asetettiin kiillotetulle arvelle siten, että solut asettuivat arven pinnalle. Päälle asetettiin useasta sideharsokerroksesta koostuva side, joka ommeltiin arven reunoihin.

Osa saadusta solususpensiosta kylvettiin petrimaljoille steriileille Polypore-kalvoille, jotka oli leikattu maljojen muotoon, toinen osa petrimaljoille ilman kalvoa. Viljely suoritettiin FAD-elatusaineessa, joka koostui DMEM:n ja F12-elatusaineen seoksesta suhteessa 3:1, lisättynä 10 % naudan sikiön seerumia, 5 μg/ml insuliinia (Sigma), 0,5 μg/ml hydrokortisonihemisukkinaattia (Sigma) ja 10 μg/ml epidermaalista kasvutekijää EGF (Institute of Cytology RAS, Pietari). Toinen ja kolmas rottaryhmä, 7 yksilöä kumpaakin, leikattiin 6 päivää ensimmäisen jälkeen. Tähän mennessä petrimaljoihin kylvettyjen keratinosyyttien suspensiosta oli muodostunut monikerroksisia kerroksia, jotka siirrettiin rottiin. Toiselle ryhmälle siirrettiin epidermosyyttejä kalvolle, kolmannelle monikerroksisella kerroksella ilman substraattia. Seitsemän päivän kuluttua saadut monikerroksiset allogeeniset keratinosyyttisolut (MPALK), jotka oli kylvetty "Polypore"-kalvoille, siirrettiin viljelmänä suoraan haavan pinnalle. Päälle kalvo kiinnitettiin monikerroksisella sideharsolla sen repeämisen estämiseksi ja ommeltiin rottien ihoon.

Ennen keratinosyyttien siirtämistä kolmanteen rottaryhmään, joita kasvatettiin ilman substraattia, PAC erotettiin petrimaljan pohjalta käsittelemällä sitä dispaasilla, jolla on kyky selektiivisesti hajottaa ihon ja epidermiksen väliset sidokset. Vaikuttaessaan monikerroksiseen kerrokseen dispaasi hajottaa tyvikerroksen solujen yhteyden petrimaljan pohjaan ja sillä on paljon pienempi vaikutus solujen välisiin yhteyksiin, mikä mahdollistaa kerroksen "poistamisen" kokonaan. Monikerroksisen solukerroksen irrottaminen dispaasilla suoritettiin seuraavasti. Kuljetusväliaine valutettiin petrimaljoista, solukerrokset pestiin kolme kertaa antibiootteja, erityisesti gentamisiinia (0,2 mg/ml), sisältävällä ravintoväliaineella. Monikerroksiset kerrokset täytettiin 0,125-prosenttisella dispaasiliuoksella ("Sigma") ja asetettiin termosaattiin, jossa niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 20–30 minuuttia. Kerroksen reunoille irtoavan valkoisen reunan ilmestyminen on merkki kerroksen irtoamisprosessin alkamisesta petrimaljan reunoista ja pohjasta. Muutaman minuutin kuluttua erotusprosessin alkamisesta dispaasiliuos valutettiin pois ja epiteelikerrokset pestiin 2-3 kertaa väliaineella. Epidermikerroksen pinnalle kiinnitettiin kupin kokoiseksi leikattu pala steriiliä "Lita-color"-haavasidosta, johon kiinnitettiin dispaasilla erotettu kerros, joka oli lisäksi kuorittu kupin pohjasta lastalla. Pinseteillä kerros yhdessä "Lita-color"-lautasliinan (Venäjä) pinnoitteen kanssa revittiin irti petrimaljan pohjasta ja siirrettiin varovasti arven valmistellulle pinnalle. "Lita-color"-lautasliinat sisältävät gentamisiinia ja eksoliinia (kollageeniuutetta), jotka kostutettuina kasvualustan jäännöksillä ja sitten fysiologisella liuoksella turposivat ja niistä tuli nykyaikainen haavasidos, joka tarjoaa hyvän suojan ulkoisilta infektioilta ja nopean paranemisen kosteutta imevän rakenteensa ansiosta.

Monikerroksiset sideharsot asetettiin Polypore-kalvojen ja Lita-color-lautasliinojen päälle ja ommeltiin rottien ihoon lujemman kiinnityksen saavuttamiseksi. Jokainen rotta sijoitettiin erilliseen häkkiin optimaalisten olosuhteiden luomiseksi sen ylläpidolle ja siirrettyjen keratinosyyttien kiinnittymiselle. Rottien, joihin suspensio ja dispaasilla poistettujen epidermosyyttien monikerroksinen kerros siirrettiin, siteet kostutettiin steriilillä suolaliuoksella useita kertoja päivässä suotuisimpien olosuhteiden luomiseksi solujen kiinnittymiselle. Koska Polypore-kalvo oli vettä läpäisemätön, toisen ryhmän rottien siteitä ei kostutettu, mikä oli yksi eduista verrattuna kalvottomiin siirtoihin. Sidokset poistettiin 10 päivän kuluttua. Solujensiirron jälkeisten arpien kliininen kuva erosi vain vähän arvista ilman siirtoa, lukuun ottamatta niiden vaaleanpunaisempaa väriä (dermabraasion vuoksi) ja suurempaa kuoriutumista. Tämä viittaa siihen, että heti haavasidosten irtoamisen jälkeen MPC:n kanssa ei arvessa tapahtunut muutoksia.

Koepalamateriaalin ottaminen rotilta.

1, 2, 5 ja 9 kuukautta rotan allogeenisten keratinosyyttien siirron jälkeen valkoisten rottien kiillotettuihin arpiin otettiin näytteet histologista, sytomorfologista ja elektronimikroskooppista tutkimusta varten. Kontrolliksi otettiin näytteitä normaalista rotan ihosta ja arvesta ilman solusiirtoa. Rottien anestesia suoritettiin eetterianestesiassa.

Anestesian jälkeen merkityiltä alueilta, joille keratinosyytit siirrettiin, otettiin 2 mm:n halkaisijaltaan olevalla koepalareilla arpikudospaloja. Palat asetettiin 2,5-prosenttiseen glutaraldehydiliuokseen elektronimikroskooppisen tutkimuksen valmistelua varten. Histologista tutkimusta varten otetut kudospalat asetettiin 10-prosenttiseen neutraaliin formaliiniliuokseen, minkä jälkeen ne johdettiin alkoholien läpi ja upotettiin parafiiniin, minkä jälkeen niistä leikattiin ohuita leikkauspisteitä ja niitä tarkasteltiin valomikroskoopilla.

Kontrolli I. Normaali rotan iho.

Jotta normaalin arpeutuneen rotan ihon mikroskooppinen kuva eroaisi MPC-siirron jälkeisistä arvista tiettyinä aikoina, tutkimuksen kaikissa vaiheissa esitetään valokuvia ja kuvauksia niistä.

Normaalin ihon epidermis koostuu 7–9 solukerroksesta. Marraskesi on kohtalaisen paksu. Joissakin paikoissa se koostuu 6–8 kerroksesta sarveiskalvoa. Tyvikerrosta edustavat sylinterimäiset solut, joilla on suuret, vaaleat, säännöllisen muotoiset tumat ja useita tumasoluja. Desmosomaaliset yhteydet solujen välillä ja tyvikalvoon ovat selvästi ilmaistuja. Selkeästi määritellyn tyvikalvon alla, jossa on pieniä ulokkeita subepidermaalisessa kerroksessa, sen kanssa rinnakkain sijaitsevat herkät kollageeni- ja elastiinisäikeiden kimput, joiden joukossa on pitkänomaisia fibroblasteja, pieniä verisuonia. Syvemmissä kerroksissa kollageeni- ja elastiinisäikeiden kimput sijaitsevat eri suuntiin. Niiden joukossa on monia saman kaliiperin ohutseinäisiä verisuonia, soluelementtejä (fibroblasteja, syöttösoluja, leukosyyttejä). Suuri määrä karvatuppeja ja talirauhasia.

Kontrolli 2. Rotan arpi, 2 kuukauden ikäinen.

Kliininen kuva. Arvet ovat vaaleanpunaisia, hilseileviä, paikoin on jäänyt rupiaa. Niiden pinta-ala on pienentynyt kollageenikuitujen supistumisen vuoksi ja on noin 3,0–3,5 cm3 ^. Ihon ulokkeet puuttuvat.

Mikroskooppinen kuva. Epidermis koostuu 3–5 taitetusta solukerroksesta, joita edustavat pyöreät tyvisolut, yksi rivi subulate-soluja, 1–2 riviä rakeista solua, joissa on keratohyaliinijyviä yläkerroksessa, on solunsisäisen turvotuksen alueita. Sarveiskerros muuttuu epätasaisesti hyvin ohuesta paksuuntuneeseen. Arven taittuminen havaitaan arpikudoksen (supistumisen) vuoksi. Taitokset tunkeutuvat papillekerrokseen ja luovat vaikutelman papilleista. Epidermiksen ja dermiksen välinen raja on suora viiva. Tyvikalvoa ei ole kaikkialla jäljitettävissä. Epidermiksen alaosassa ja syvemmissä kerroksissa on verisuonia, joilla on paksu, löysä seinämä, monet ovat autioita ja staasissa. Verisuonten ympärillä on makrofagien, fibroblastien, kertyminen. Makrofagit ympäröivät kapillaareista vapautuvia punasoluja ja fagosytoivat ne. Pinnallisissa kerroksissa on pieniä kapillaareja. Epidermiksen alla kollageenikuidut sijaitsevat löyhästi. Arven syvemmässä kerroksessa on karkeita kollageenikuitukimpuja, joiden joukossa on paljon fibroblasteja.

Rotan arpi kuukausi rotan keratinosyyttien siirron jälkeen.

Kliininen kuva. Arvet ovat vaaleanpunaisia, niiden pinta-ala on pienentynyt, erityisesti halkaisijaltaan, ja ne ovat keskimäärin 2,5–3 cm ². Hiukset ja talirauhaset puuttuvat.

Mikroskooppisen tutkimuksen tiedot rotilta, joille siirrettiin MPaLK filmille ja MPaLK ilman substraattia, ovat käytännössä identtiset. Puhtaasti teknisesti ottaen MPaLK:n kanssa työskentely ilman substraattia on kuitenkin paljon monimutkaisempaa ja työläämpää kuin MPaLK:n kasvattaminen substraatilla, joten tutkiessamme edelleen keratinosyyttien siirtoa arpiin, käytimme monikerroksista kambria kasvun perustana ("substraatit").

Mikroskooppinen kuva. Epidermiksen paksuuntuminen on havaittavissa 15-20 kerrokseen, lähes keskelle kerrosta asti keratinosyyteillä on kapea, pitkänomainen, pystysuora muoto ja tiivis järjestys. Tyvisolut sijaitsevat epätasaisessa linjassa. Niiden tumat ovat kevyitä, suuria, pyöreitä ja niissä on yksi tai kaksi tumakeinoa, mikä osoittaa niiden korkeaa synteettistä ja proliferatiivista aktiivisuutta. Epidermiksen ja dermiksen välinen raja on suora. Okaskerros on hyvin kehittynyt, koostuu 3-5 kerroksesta pyöreitä soluja, on 2 tumakeinoa.

Välittömästi tyvikalvon alla on tiheästi sijoittuneita ohuita kollageenikuitukimpuja, joiden rinnalla on suuri määrä autioita verisuonia, syvemmillä kollageenikuidut ovat karkeampia, kerääntyneinä tiheisiin kimppuihin. Monet suuret fibroblastit, mastosolut (2-3 näkökentässä), makrofagit, leukosyytit ja autiot verisuonet, joiden seinämät ovat löysät, niiden ympärillä on löysästi sijoittuneita kollageenikuituja. Joissakin verisuonissa on staasia, muodostuneiden elementtien diapedeesia. Verisuonten ympärillä on fibroblasteja, yksittäisiä lymfosyyttejä. Ihon lisäkkeet puuttuvat.

Kun keratinosyyttisuspensio siirretään kiillotetulle arvelle, mikroskooppinen kuva poikkeaa edellisestä. Useimmilla eläimillä epidermis on ohut ja koostuu 5-6 solukerroksesta. Alempi kerros koostuu epäsäännöllisen, monikulmaisen muotoisista soluista, joiden tumat ovat pyöreän epäsäännöllisen muotoisia. Epidermaalikerroksen tila on samanlainen kuin eläinryhmässä, jolle ei ole tehty MPALK-siirtoa.

Tässä tapauksessa voimme puhua joko solunsiirtoon liittyvien prosessien viivästymisestä tai suspensiona siirrettyjen solujen suuresta menetyksestä. Siksi tehtiin johtopäätös arven korjauksen tarkoituksenmukaisuudesta siirtämällä keratinosyyttejä suspensiona.

Rotan arpi 2 kuukautta rotan keratinosyyttien siirron jälkeen.

Kliininen kuva. Arpi näyttää ohuelta ja herkältä. Paikoin havaitaan hilseilyä ja hilseileviä läiskiä.

Mikroskooppinen kuva. Sarveiskerros on paksuuntunut, paikoin - hyperkeratoosi. Epidermis on paksuuntunut, koostuu 12-20 solurivistä. Epidermiksen ja dermiksen välinen raja on suora viiva. Epidermiksen alla olevat herkät kollageenikuidut sijaitsevat melko tiheästi. Arven syvemmissä kerroksissa ne kerääntyvät suuriksi karkeiksi kimppuiksi. Epidermiksen alapuolella olevassa kerroksessa esiintyy uutta verisuonten muodostumista. Arpikudoksen alemmissa kerroksissa on monia autioita verisuonia, jotka sijaitsevat epidermiksen pinnan suuntaisesti. Suuret fibroblastit jakautuvat tasaisesti arven paksuuteen, siellä on jättimäisiä, monihaaraisia, paljon makrofageja.

Rotan arpi 5 kuukautta rotan epidermaalisten solujen siirron jälkeen.

Kliininen kuva. Arpi näyttää tasaiselta ja sileältä ilman hilseilyä. Siinä on yksittäisiä karvoja, joiden tiheys on suurempi arven reunoilla, mikä viittaa karvatuppien vähäiseen sisäänkasvuun arpeen ja uusien karvatuppien muodostumiseen. Arpien pinta-ala pienenee edelleen.

Mikroskooppinen kuva. Epidermis on edelleen paksu (15–20 kerrosta, paikoin jopa 30). Ylemmissä kerroksissa se on täynnä keratohyaliinijyviä. Tyvikalvo on selvästi näkyvissä. Sen alla kollageenikuidut ovat löyhästi. Alemmissa kerroksissa kollageeni on voimakkaampaa ja tiiviimmin pakkautunutta. Kollageenikimppujen joukossa on paljon hiussuonia. Ylemmissä kerroksissa autioituneiden verisuonten määrä on vähentynyt. Epidermiksen ja dermiksen liitoskohta on hieman aaltoileva. Joissakin paikoissa on syviä epidermaalisia kasvustoja arpikudoksessa. Kollageenikuitujen joukossa näkyy vasta muodostuneita verisuonia. Yksittäisiä karvatuppeja ja talirauhasia ilmestyy.

Rotan arpi 9 kuukautta rotan epidermaalisten MPA-solujen siirron jälkeen.

Kliininen kuva. Arvet ovat pienentyneet huomattavasti aiempiin aikoihin verrattuna, niiden pinta-ala on keskimäärin noin 1,5–2,0 cm2 ^. Arvet ovat epätasaisesti hienojen karvojen peitossa, erityisesti reunoilla. Vähäistä hienolevyistä kuoriutumista on jäljellä.

Mikroskooppinen kuva.

Epidermis on ohentunut, sitä edustaa 6-8 soluriviä, rakenteeltaan se muistuttaa normaalin rotan ihon epidermistä, vain solutiheys on 1 mm korkeampi ja ne ovat pienempiä. Tyvikerros koostuu pienistä pyöreistä, sylinterimäisistä soluista. Tyvikalvo on hyvin ilmeinen, hemidesmosomit ovat selvästi näkyvissä. Epidermaalikasvustot havaitaan subepidermaalisessa kerroksessa. Papillerikerros on ilmeinen koko arven pituudelta. Nämä tosiasiat viittaavat siihen, että siirrettyjen keratinosyyttien tarttuminen alla oleviin arpikudoksiin on tähän mennessä vahvistunut huomattavasti. Siksi arvenhoito MPALK-siirteen saaneilla 9 kuukautta MPC-siirteen jälkeen voi olla perinteistä. Epidermiksen alla kollageenikuidut ovat herkempiä kuin syvissä kerroksissa. Monet verisuonet ovat ilmestyneet, erityisesti pinnallisia. Suurempien verisuonten seinämät ovat paksuuntuneet. Karvatupet ja talirauhaset ovat suuria määriä. Mikroskooppinen kuva muistuttaa ihokudosta.

Kokeellisen työn tulokset ja niiden tarkastelu.

Tämän työn aikana eri muodoissa olevia keratinosyyttejä siirrettiin keinotekoisesti luotuihin rotan ihon arpiin dermabrasioleikkauksen jälkeen - haavapeitteille, suspensiona kambrille ja monikerroskerroksena ilman substraattia. Työn tavoitteena oli saada morfologista tietoa siirrettyjen allogeenisten keratinosyyttien vaikutuksesta arpiin sekä määrittää optimaaliset siirtovaihtoehdot.

Kaikkien kolmen siirtomenetelmän todettiin olevan mahdollisia, mutta MPAC:n siirto ilman substraattia on erittäin työläs toimenpide, jonka aikana MPAC voi vaurioitua, mikä vaikuttaa siirron tuloksiin. Lisäksi tämä siirtomenetelmä sulkee pois työskentelyn laajoilla pinnoilla.

Keratinosyyttisuspensiosiirto on huomattavasti kustannustehokkaampi menetelmä, ei vaadi pitkäaikaista soluviljelyä ja on yksinkertainen ehdottamamme version mukaisesti käyttäen steriilejä kambrisia aihioita, joiden koot vastaavat arpien kokoa. Solususpension siirron terapeuttisen vaikutuksen viive noin kuukaudella verrattuna MPC:hen haavan pinnoitteelle ei ole merkittävä seikka useiden kuukausien hoidon keston aikana. On tunnettua, että kun MPC:tä siirretään palovammapotilaille, ihorakenteen muutos tapahtuu vähitellen ja useiden vuosien aikana. Keratinosyyttiviljelmän siirto haavan pinnoitteille on kätevin ja lupaavin menetelmä, mutta myös huomattavasti kalliimpi. Lisäksi se vaatii tällä hetkellä edistyneempien pinnoitusvaihtoehtojen etsimistä, joiden tulisi olla joustavia, hygroskooppisia, joilla tulisi olla bakteriostaattisia tai bakterisidisia ominaisuuksia ja jotka olisivat biologisesti neutraaleja soluille. "Polypor"-kalvo - kotimaisen kalvohaavapeitteen väliversio - mahdollisti joistakin epätäydellisyyksistä huolimatta kokeellisesti tutkia rotan keratinosyyttien siirtoa arpiin ja tehdä johtopäätöksiä tämän arpien hoitosuunnan tehokkuudesta.

Palovammoihin MPC:tä siirtäneet kirjoittajat totesivat, että ensimmäisen viikon aikana sen jälkeen, kun monikerroksinen keratinosyyttikerros oli siirretty desinfioituihin haavoihin, epidermis paksuuntui ja kerrostui. Kaikki epidermiksen kerrokset olivat selvästi näkyvissä. Mielenkiintoista on, että solukerrosten määrä siirteissä oli 10–30 % suurempi kuin ihobiopsioissa. Kirjoittajat totesivat keratohyaliinirakeiden ilmestymisen viidentenä päivänä MPC-siirron jälkeen ja tyvikalvon ja hemidesmosomien jo kolmantena päivänä.

J.Rives ym. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM ym. (1998) havaitsivat, että MPC-siirteen alkuvaiheessa potilailla, joilla on palovammojen jälkeen täyspaksuisia ihovaurioita, dermiksen ja epidermiksen välinen yhteys on hyvin heikko ja suoraviivainen, eikä nystykerrosta ole. Toisen kuukauden loppuun mennessä alkaa muodostua matalia nystyjä ja iholisäkkeitä, ja dermiksen ja epidermiksen välinen yhteys vahvistuu. Kirjallisuustiedot osoittavat, että allogeenisten keratinosyyttien siirto palovammapotilaiden haavoihin on lupaava menetelmä. Huolimatta siitä, että allogeenisten keratinosyyttien hylkiminen tapahtuu eri kirjoittajien mukaan 10 päivän - 3 kuukauden kuluessa, ne osallistuvat kuitenkin haavan pinnan paranemiseen, kasvutekijöiden erittämiseen ja vaurion mekaaniseen sulkemiseen. MPALC-solujen uskotaan olevan heikentyneen antigeenisen aktiivisuuden, koska in vitro -viljelyn aikana ne menettävät Langerhansin soluja, mikä mahdollistaa niiden pitkäaikaisen olemassaolon vastaanottajan kehossa. Lisäksi nuorten terveiden ihmisten ihosta saadulla allogeenisella viljelmällä on vertaansa vailla suurempi biologinen potentiaali kuin potilaiden autologisella viljelmällä vamman jälkeen.

Tutkimuksemme päätavoitteena oli selvittää, juurtuvatko allogeeniset keratinosyytit arpiin ja mitä muutoksia arpikudoksessa tapahtuu tällaisen biologisesti aktiivisen "haavapäällysteen" vaikutuksesta. Positiivisen tuloksen tapauksessa kehittää tehokkain ja vähiten työvoimaa vaativa teknologia tälle kuntoutuslääketieteen alueelle.

Saamamme tiedot olivat monella tapaa samankaltaisia kuin kirjallisuudessa annetut tiedot ihmisen epidermiksessä tapahtuvista morfologisista muutoksista allogeenisten keratinosyyttien siirron jälkeen palovammoihin. On kuitenkin myös merkittäviä eroja sekä morfologisen alustan, jolle siirto tapahtuu, että teknologian suhteen. Siten tyvikalvon ja dermis-epidermis-yhteyksien (hemidesmosomit, nystyrät) muodostumisprosessi tapahtuu myöhemmässä vaiheessa verrattuna keratinosyyttien siirtoon haavapinnoille ilman arpikudoksen muutoksia. Ilmeisesti tämä johtuu arpikudoksen huonommasta ravinnosta verrattuna dermikseen tai lihasfaskiaan. Arpi, erityisesti vanha, on tiheää sidekudosta, jossa on hyvin vähän verisuonia, kun taas palovamman pohja on verisuonipitoista granulaatiokudosta. On siis ilmeistä, että olosuhteet, joissa keratinosyyttien siirto ja kiinnittyminen tapahtuvat, ovat täysin erilaiset. Mitä verisuonittuneempi solujen siirtoalue on, sitä helpompi niiden kiinnittyminen on. Tästä postulaatista seuraa johtopäätös, että on suositeltavaa työskennellä nuorten arpien kanssa, joissa sidekudos on vielä melko löysää ja verisuonipitoista.

Tämän kokeellisen työn tuloksena todistettiin, että:

1. MPALKin siirto arpiin on mahdollista.
2. Optimaalinen siirtomenetelmä on keratinosyyttien siirto haavan päälle.
3. Arven pinta tulee kiillottaa kirurgisella laserdermabrasiolla tai Schumann-leikkurilla.
4. MPALKin vaikutuksesta arven kiillotettu pinta epiteelisoituu nopeasti.
5. Mitä paremmin arpikudos on verisuonittunut eli mitä nuorempi arpi on, sitä parempia ovat keratinosyyttien siirron tulokset.
6. Siirrettyjen keratinosyyttien vaikutuksesta arpikudos muuttuu vähitellen ihon kaltaiseksi (löysemmäksi arpikudokseksi, jossa on iholisäkkeitä).
7. Arpikudoksen asteittainen irtoaminen, alkaen epidermaalisesta kerroksesta. Sen verisuonittuminen paranee, arven ylä- ja alaosien kollageenisäikeiden kimput asettuvat löyhemmin kuin arpikudoksessa ilman solusiirtoa. Karvatupet ja talirauhaset ilmestyvät. Epidermis lähestyy rakenteeltaan normaalin ihon epidermistä ohitettuaan hypertrofiavaiheen.
8. Havaitut muutokset liittyvät keratinosyyttien erittämiin kasvutekijöihin ja sytokiineihin, jotka parantamalla arpikudoksen trofismia edistävät sen muuttumista karkeasta sidekudoksesta löyhemmäksi kudokseksi, mikä johtaa arven ulkonäön paranemiseen.

Tämän tutkimuksen perusteella voidaan siis päätellä, että siirretyillä keratinosyyteillä on hyödyllinen vaikutus arpikudokseen, millä voi olla käytännön merkitystä erityyppisten arpien omaavien potilaiden kuntoutuksessa.

Tämä rotilla tehty työ mahdollisti myös sen, että pystyimme muotoilemaan vaatimukset haavapeitteille, joilla keratinosyyttejä kasvatetaan.

Haavasidosten tulisi olla:

• bioyhteensopiva solujen kanssa,
• hengittävä,
• on joustava, muotoaan säilyttävä pohja,
• olla hydrofiilinen,
• koska lääkkeiden lisäaineet sisältävät antibakteerisia lääkkeitä ja antioksidantteja, jotka eivät ole myrkyllisiä viljellyille soluille.

Arpien bioteknologisen hoidon kliiniset tulokset.

Aikaiemmin N. Carver ym. (1993) havaitsivat, että okklusiiviset sidokset edistävät parhaiten kiinnittymistä haavaan ja keratinosyyttien selviytymistä, mutta eivät salli kerrostuneen (kypsän) epidermiksen muodostumista. Kerrostuneen epidermiksen muodostumiselle tarvitaan ilmava ympäristö. Siksi monikerroksisen kerroksen kiinnittämisen jälkeen ehdotettiin okklusiivisen haavasidoksen poistamista 7-10 päivän kuluttua ja haavojen hoitamista kuivilla sidoksilla tai vesiliukoisilla voiteilla. Voidaan sanoa, että solujen kasvatuksessa käytettävän "alustan" laatu ja ominaisuudet ovat erittäin tärkeä seikka solumateriaalin siirron tehokkuudelle ja siten lääkäreiden työn tuloksille. Mutta nykyään ei ole olemassa ihanteellista haavasidosta, huolimatta ehdotettujen vaihtoehtojen runsaudesta (keinotekoinen iho, karboksimetyyliselluloosasta valmistettu kuitukangas, fibriinipinnoitteet, puoliläpäisevät polyuretaanikalvot). Tärkeä seikka tässä asiassa on "alustojen" (erityisten haavapeitteiden) hinta, koska niiden korkea hinta lisää bioteknologisen hoidon kokonaiskustannuksia.

Soluteknologioiden tehokkuus on tähän mennessä todistettu, mutta valitettavasti nämä teknologiat ovat erittäin kalliita, erityisesti maissa, joissa solukoostumusten teollista tuotantoa ei ole vielä vakiintunut. Yhdysvallat on kuitenkin jo pitkään kehittänyt teollisuuden palovammojen siirtoon tarkoitetun solumateriaalin tuotantoon. Erityisesti BioSurface Technology Inc. -yritys on vuodesta 1989 lähtien kasvattanut 37 000 monikerroksista keratinosyyttikerrosta, joita on käytetty 240 potilaan hoitoon 79 maassa ympäri maailmaa (R. Odessey, 1992), kun taas 1 cm2 soluviljelyä ^maksaa noin 7–8 Yhdysvaltain dollaria.

Erilaisten ihosairauksien ja -ongelmien hoitotekniikassa on useita eroja, mutta kaikki soluhoidot perustuvat korkealaatuisen solumateriaalin hankkimiseen ja sen siirtoon.

Tämä prosessi koostuu seuraavista vaiheista:

• ihon ottaminen uhreilta (tai luovuttajilta)
• iholäppien kuljettaminen bioteknologiakeskukseen,
• tyvikerroksen solujen eristäminen ja niiden lisääntyminen,
• monikerroksisten keratinosyyttikerrosten (MLK) kasvu.
• soluviljelmäsiirto.

Monikerroksisten keratinosyyttilevyjen siirtoon perustuvan hoidon pääongelma on elinkelpoisten solujen tarve kaikissa solusiirron vaiheissa. Autologisten tai allogeenisten solujen eristämiseen tarkoitettujen ihopalojen tulisi olla mahdollisimman ohuita, koska tässä tapauksessa ne on helpompi erottaa mekaanisilla ja entsymaattisilla menetelmillä ja saada elävien solujen suspensio viljelyä varten. Ne voidaan saada leikkaamalla dermatomilla tai käyttämällä silmäluomien, esinahan ja olkapään sisäpinnan ihoa. Koska solut ovat herkkiä halogeeneille (kloori, jodi) ja vetyperoksidille, niitä ei voida käyttää ihon käsittelyssä materiaalin keräämisen aikana.

Ihosiirteistä saatavien solujen määrällinen ja laadullinen saanto sekä niiden viljelyn tehokkuus riippuvat myös luovuttajan terveydentilasta ja iästä. Lisäksi ihobiopsiat on toimitettava mahdollisimman nopeasti ja asianmukaisissa olosuhteissa (ympäristö, lämpötila) näihin tarkoituksiin sertifioituun ja akkreditoituun laboratorioon.

Iholäppien säilytykseen ja kuljetukseen voidaan käyttää Eagle'n elatusainetta tai elatusainetta 199, johon on lisätty 10 % naudan seerumia, DMEM-elatusainetta, johon on lisätty 5 % naudan sikiön seerumia, sekä antibiootteja.

Sytologian laboratoriossa ihobiopsia jaetaan ensin mekaanisesti pieniksi paloiksi, minkä jälkeen ihopalat käsitellään entsyymien, kuten trypsinin, kollagenaasin, dispaasin jne., avulla.

Entsyymien vaikutuksesta desmosomit tuhoutuvat ja keratinosyytit vapautuvat kasvualustaan yksittäisinä soluina tai eri määristä soluja koostuvina aggregaatteina. Viljelyyn käytetään vain tyvikeratinosyyttejä, joita kasvatetaan erityisillä kasvualustoilla 5 % CO2:ta sisältävissä termostaateissa, petrimaljoissa tai pulloissa t = 37 °C:n lämpötilassa. Jo 48 tunnin kuluttua havaitaan keratinosyyttipesäkkeiden muodostumista, jotka vähitellen yhdistyvät ja muodostavat yksikerroksisen kerroksen. Kun riittävä määrä soluja on saatu, tuloksena oleva suspensio kylvetään tätä tarkoitusta varten valmistettuihin haavasidoksiin ja asetetaan petrimaljoihin. Suspensiosta muodostetaan ensin yksikerroksinen ja sitten monikerroksinen keratinosyyttikerros. Keratinosyyttien viljelyprosessin vaiheet on esitetty kaaviomaisesti kuvassa 12 (33,43,54,65).

Siirtoon soveltuvan monikerroksisen keratinosyyttikerroksen muodostuminen kestää yleensä 7–10 päivää. Joskus tämä aika on pidempi, mikä riippuu lähtömateriaalin laadusta (ikä, luovuttajan terveydentila, materiaalinkeräyksen oikeellisuus, käytettyjen elatusaineiden laatu jne.). Jos monikerroksinen kerros kasvaa liikaa, sen pinnalle voi ilmestyä soluja, joilla on siirtoon sopimattomia apoptoosi-ilmiöitä. Petrimaljat, joissa on haavapeitteillä kasvatettuja monikerroksisia keratinosyyttikerroksia (MLK), toimitetaan klinikalle erityisissä astioissa vähintään +15 °C:n lämpötilassa.

Muokattu Greenin menetelmä MPC:n kasvattamiseen

Työssämme käytimme haavan päällysteenä monikerroksista kambriumia ja hylkäsimme "Polypor"-kalvot, joita käytimme alun perin rotilla tehdyissä kokeissa. Kasvatimme siis monikerroksisia keratinosyyttikerroksia esirasvatulle ja steriilille kambriumille, vaikka sekään ei ole optimaalinen haavan päällyste.

Kliiniset tutkimukset tehtiin vapaaehtoisilla noudattaen tarvittavia eettisiä standardeja: sopimuksen allekirjoittamista ja tietoon perustuvaa suostumusta.

1. Käytettiin potilaan omien (autologisten) ja pankkiin tallennettujen (allogeenisten) keratinosyyttien viljelmää.
2. Potilaiden omat keratinosyytit saatiin ihonpalasta, joka leikattiin heidän olkavarsiensa sisäpuolelta.
3. Arven dermabrasioleikkaus tehtiin lämpökauterilla, pyörivillä levyillä ja erbiumlaserilla.
4. Otettiin ryhmiin potilaita, joilla oli normotrofisia, hypotrofisia ja hypertrofisia arpia.

Soluteknologian soveltamisen teknologinen prosessi ihoarpien ulkonäön parantamiseksi koostui seuraavista vaiheista:

1. Potilaan valinta.
2. Selitykset hoidon ytimestä, odotettujen tulosten saavuttamiseksi tarvittavasta aikataulusta, sopimuksen allekirjoittamisesta ja tietoisesta suostumuksesta.
3. Määrää potilaille 2-3 viikkoa ennen leikkausta selmevit 1 tabletti 3 kertaa päivässä, zinctheral 1 tabletti 3 kertaa päivässä.
4. Otetaan 2,0 cm pitkä ja 0,7–1,0 cm leveä ihopala olkapään sisäpinnalta, korkealta, lähes kainalon alaosasta, autologisten keratinosyyttien saamiseksi.
5. Tapauksissa, joissa potilaat kieltäytyivät omien keratinosyyttiensä eristämisestä olkapään sisäpinnalla mahdollisesti olevan lineaarisen arven vuoksi, solumateriaali otettiin solupankista (allogeeniset keratinosyytit).
6. Keratinosyytit eristettiin ja kasvatettiin laboratoriossa, joka on sertifioitu tämän tyyppiseen työhön.
7. Kun MPC:tä oli saatu riittävästi arpiin siirtämistä varten, klinikalle sovittiin leikkauspäivä, jonne materiaali tuotiin petrimaljoihin pakatuissa erityisissä astioissa.
8. Arven dermabrasioleikkaus suoritettiin, hemostaasi tyrehdytettiin, kiillotettu pinta pestiin steriilillä suolaliuoksella, kuivattiin, minkä jälkeen MPC:t siirrettiin sille steriileille kambrisille "soluille alaspäin". Toisin sanoen MPC:n yläosassa olevat solut osoittautuivat alemmiksi, kiillotetun pinnan viereen.
9. Päälle asetettiin steriili kalvo, joka kiinnitettiin ihoon joustavalla siteellä tai elastisella Omnifix-laastarilla. Kalvon sijaan voidaan käyttää silikonia sisältäviä indiferenttejä haavasidoksia, esimerkiksi Mepitelia, Mepiformia tai silikonigeelilevyjä.

5–7 päivän kuluttua kalvo tai silikonipinnoite poistetaan. Tähän mennessä kaikkien keratinosyyttien pitäisi olla ryömineet kiillotetun arven päälle ja kiinnittyneet sen pintaan.

10. Kalvon ja silikonipinnoitteen alle syntyvä kostea ympäristö edistää tätä aktiivisesti. Tästä eteenpäin arpeen jäävä kambri voidaan kastella curiosin- tai kitosaanigeelillä. Tämän seurauksena toisena päivänä muodostuu tiivis kuori, joka potilaan mukavuuden vuoksi on parasta kiinnittää joustavalla, hengittävällä laastarilla, kuten Omnifixilla. Hengittävä kuori mahdollistaa muodostuneen epidermiksen erilaistumisen ja kypsymisen.

Arven tyypistä ja hionnan syvyydestä riippuen side hylkiytyy 8–10 päivän kuluttua. Tällöin epidermiksessä on 30–40 % enemmän solukerroksia kuin normaalissa ihossa. Tyvikalvoa ei ole muodostunut. Paksuuntuneen epidermiksen keratinosyytit erittävät paljon biologisesti aktiivisia molekyylejä arpikudokseen.

Bioteknologisen arvenhoidon onnistuminen riippuu pitkälti leikkauksen jälkeisen hoitomenetelmän valinnasta. Soluviljelmät ovat "hellävarainen" haavanhoitomuoto, ja elinsiirron jälkeisissä alkuvaiheissa invasiiviset arvensisäiset kalvot (IPC) voidaan helposti irrottaa alla olevista kudoksista. Siksi potilaita kehotetaan käsittelemään arpea varoen leikkauksen jälkeen. Älä hiero arpea 8–9 kuukauden ajan ja käsittele varovasti kylmällä keitetyllä vedellä, jotta ohut, vasta muodostunut epidermis, jolla ei ole tiivistä sidosta alla oleviin kudoksiin, ei repeydy.

Huomautus.

Ennen leikkausta ja dermabrasion aikana halogenoitujen antiseptisten aineiden ja hapettimien (jodopyroni, suliodopyroni, jodinoli, jodinaatti, klooriheksidiini, vetyperoksidi) käyttö on sallittua, ennen solunsiirtoa - on ehdottomasti vasta-aiheista niiden sytotoksisen vaikutuksen vuoksi. Metyleenisininen ja briljanttivihreä ovat myös myrkyllisiä soluille.

Infektioiden välttämiseksi, erityisesti hypertrofisten arpien kanssa työskenneltäessä, leikkausaluetta voidaan hoitaa neomysiinisulfaatilla, polymyksiinillä tai gentamisiinilla. Näillä ei ole sytotoksista vaikutusta keratinosyytteihin.

Tällaisen hoidon tuloksena saavutetaan kolminkertainen vaikutus.

1. Arven pinnan tasoitus.
2. Uuden, normaalin paksuisen epidermiksen kerroksen muodostuminen sen päälle.
3. Arpikudoksen muuttuminen ihon kaltaiseksi kudokseksi sytokiinien, kasvutekijöiden ja muiden siirrettyjen solujen erittämien ja niiden stimuloimien keratinosyytit, fibroblastit ja makrofagit -aineiden vaikutuksesta.

Arpi muuttuu vähemmän havaittavaksi, joustavammaksi, siihen ilmestyy huokosia ja vellus-hiuksia, ja pigmentti voi palautua IPC:ssä olevien melanosyyttien vuoksi.

Kaikki nämä arven positiiviset puolet eivät kuitenkaan ilmene välittömästi. Tässä suhteessa on tarpeen varoittaa potilaita, että arpikudoksen muuttuminen ihokudokseksi tapahtuu hitaasti ja tällaisen hoidon optimaalista tulosta voidaan odottaa aikaisintaan 10–14 kuukauden kuluttua. Heti sidosten hylkäämisen jälkeen kiillotetuilla pinnoilla on voimakas polykromia, mitä kirkkaampi, sitä syvempi kiillotus on suoritettu. Vähiten ihovaurioita havaitaan, kun normotrofisia arpia kiillotetaan erbiumlaserilla. Arpien ja ympäröivän ihon väri palautui 3–8 viikon kuluessa. Näistä varotoimista huolimatta joskus esiintyy leikkauksen jälkeistä hyperpigmentaatiota, joka voi hävitä itsestään muutamassa kuukaudessa.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]